尿蛋白电泳范文
尿蛋白电泳范文（精选8篇）
尿蛋白电泳 第1篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择新疆维吾尔自治区人民医院2010年1-12月收治的肾脏病患者共270例,其中男147例,女123例,年龄2～86岁,平均44岁。汉族58例,少数民族212例。
1.2 仪器和试剂
仪器采用法国Sebia公司HYDRASYS全自动琼脂糖凝胶电泳系统,试剂采用公司配套的试剂盒,电泳凝胶(HYDRAGEL5,08110/02),琼脂糖凝胶(凝胶含琼脂糖8 g,Tris巴比妥缓冲液,pH 8.8±0.1),缓冲条(HYDRAGEL,24110/01)采用酸性结晶紫染液(浓缩结晶紫溶液加蒸馏水稀释,稀释后含2 g/L结晶紫),柠檬酸脱色液(3 g柠檬酸+5.0 L双蒸水),柠檬酸钠清洗液(10 g柠檬酸钠+5.0 L双蒸水)。扫描仪软件为PHORESIS450。
1.3 方法
收集患者尿液5～10 ml进行尿常规检测。如果检测结果中尿蛋白为阴性或“+”,则用原尿进行尿蛋白电泳。若为“++”以上,尿液需用生理盐水进行相应比例稀释之后电泳。吸取20μl稀释液与80μl尿液混匀,静置5 min。吸取5μl加至凝胶孔中,电泳底板加入200μl蒸馏水,吸去胶片表面水分,打开电泳仪,选择尿蛋白电泳程序(PROTEINURIE),接缓冲条带,将凝胶置于电泳槽控温板上,启动电泳(20℃,221 V,91 mA)30 min。待电泳结束后取出电泳凝胶,置于染色架上,进行烘干、染色、脱色、固定、干燥程序,最后将胶片进行扫描分析。
1.4 统计学处理
数据采用SPSS 17.0和EXCEL 2003进行统计分析,对于性别之间、不同民族之间的蛋白尿类型进行字2检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
根据尿蛋白分子量大小,同时与蛋白标准带进行对比,扫描后发现尿蛋白电泳结果可分为肾小球性蛋白尿、肾小管性蛋白尿、生理性蛋白尿、混合性蛋白尿。270例蛋白尿中有69例肾小球性蛋白尿(25.6%),电泳条带显示位置在样本加样点与白蛋白之间,主要是白蛋白。27例肾小管性蛋白尿(10%),电泳条带位于白蛋白和凝胶片阳性端之间。116例为混合性蛋白尿(42.9%),35例为生理性蛋白尿(12.9%),尿蛋白含量很低。其余为阴性尿。见表1。
本研究收集270例肾脏病患者的尿液进行尿蛋白电泳。分析发现少数民族患者占据大多数(78.5%),结果以混合性蛋白尿居多。男、女比例适当,基本可以达到1:1。见表2。
例
对于表2所示结果分别进行不同性别患者蛋白尿类型的字2检验。以各种类型蛋白尿的结果和男、女不同性别之间提出零假设,认为不同性别之间蛋白尿类型有差异,根据概率乘法法则,计算字2值,确定自由度df(本次统计中df=4),由表2中数据进行计算字2值为19.61,字2>字4,0.05,即P<0.05。分析发现,不同性别之间蛋白尿类型差异具有统计学意义(P<0.05)。
同样,对于表2所示结果分别进行不同民族患者蛋白尿类型的字2检验。以各种类型蛋白尿的结果和不同民族之间提出零假设,认为不同民族之间蛋白尿类型有差异,根据概率乘法法则,计算字2值,确定自由度df(本次统计中df=4),由表2中数据进行计算字2值为101.86,字2>字4,0.05,即P<0.05。分析发现,不同民族之间蛋白尿类型差异具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
尿蛋白电泳可以区分尿中不同组分[5]。根据尿蛋白电泳图谱分析发现,以白蛋白为界,分子量小于白蛋白的低分子蛋白能通过肾小球滤膜,被肾小管重吸收,当肾小管受损时,这些低分子蛋白会增多,产生肾小管性蛋白尿,提示肾小管受损。分子量高于白蛋白的高分子蛋白会使肾小球通透性增大,损伤肾小球,产生肾小球性蛋白尿。而当病变同时累及肾小球和肾小管时,会产生混合型蛋白尿。
本研究270例蛋白尿中,有147例为男性,123例女性,其中58例汉族,212例为少数民族。主要以混合性蛋白尿为主。由于样本采集所在医院为民族聚居区,因此,样本收集过程中少数民族居多,这也符合新疆属于多民族地区的特点。统计学分析不同性别、民族之间蛋白尿类型差异具有统计学意义,分析原因之一为本次收集标本具有随机性。此外,男女之间,不同民族之间由于其生理结构特点和生活习性不同,也会导致蛋白尿类型有所差异。
检测肾损伤部位和程度的方法很多,以往肾活检可以反映肾损伤程度,但活检创伤大[6]。而尿蛋白电泳能检测尿中成分的变化,可协助临床诊断肾损伤的程度,而且整个过程简便、无创伤,因此,对肾脏疾病的诊断、治疗、预后具有重要价值。
摘要：目的:研究尿蛋白电泳在肾脏疾病诊断中的应用。方法:收集270例肾脏病患者尿液进行尿蛋白电泳,分析各蛋白尿各组分百分比。结果:270例蛋白尿中有69例为肾小球性蛋白尿,27例为肾小管性蛋白尿,35例为生理性蛋白尿,116例为混合性蛋白尿。不同性别、民族之间蛋白尿类型不同,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:尿蛋白电泳可帮助临床诊断肾脏疾病。
关键词：尿蛋白电泳,肾脏疾病,临床应用
参考文献
[1]刘恩才.尿蛋白电泳在肾脏疾病中的临床应用[J].内蒙古医学杂志,2011,43(8):962-963.
[2]吴双,吴晓虹,黄伟,等.尿蛋白电泳在临床上的应用[J].中国医学研究与临床,2007,5(6):49-50.
[3]沈霞,张敏华,汪萍,等.非浓缩尿蛋白电泳的临床应用[J].中华检验医学杂志,2001,24(5):266.
[4]廖伟.尿蛋白电泳临床应用[J].家庭医药:医药论坛,2009,(1):29-30.
[5]董雪梅,孙睿轩,周秀,等.尿蛋白电泳在肾脏疾病评估中的作用[J].武警医学院学报,2008,17(12):1077-1079.
尿蛋白电泳 第2篇
油菜叶片总蛋白质双向电泳样品制备方法的改进
以甘蓝型油菜“扬油6号”的叶片为试验材料,分别采用传统的TCA/Acetone(三氯乙酸/丙酮沉淀法)和改进的PEG(polyethylene glycol)分步提取法提取叶片可溶性总蛋白,并利用条件一致的蛋白质双向电泳体系进行比较.TCA/Acetone法提取的蛋白质双向电泳图谱背景中由于高丰度“housekeeping”结构蛋白的存在,特别是叶片中参与光合作用的Rubisco蛋白的干扰,图谱中低丰度调控蛋白受到了高度覆盖和遮蔽现象,影响双向电泳图谱的质量.而PEG分步提取法提取的蛋白质样品,可以剔除Rubisco蛋白,使获得的`双向电泳图谱清晰,无斑点间的遮蔽现象,为油菜叶片蛋白质组定量和定性分析提供了丰富的信息.
作 者：孔芳 蒋金金 吴磊 葛才林 王幼平作者单位：扬州大学生物科学与技术学院,扬州,225009刊 名：生物技术通报 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：“”(5)分类号：关键词：油菜 叶片总蛋白 双向电泳 图谱
尿蛋白电泳 第3篇
1 材料与方法
1.1 标本来源
江苏省中医院2011年1月~12月134例肾内科住院患者,其24h尿蛋白定量(UTP)均>150mg/天,其中男76例,女58例,年龄34~81岁,平均年龄54.3岁。其中31例做过肾活检。均取晨尿进行尿蛋白电泳分析。
1.2 仪器与试剂
电泳仪HYDRASYS SEBIA PN1210,法国SEBIA公司制造。SEBIA电泳仪配套试剂盒。
1.3 方法
取20μL SDS-溴酚兰加入80μL尿液标本,(注:如果尿液蛋白含量>2g/L,则稀释至大概2g/L左右。)根据说明书做尿蛋白电泳分析,电泳仪扫描,鉴定,出结果。
2 结果
2.1 134例尿蛋白电泳结果
见表1。由表1显示,3例生理性蛋白尿,108例肾小球型蛋白尿,9例肾小管型蛋白尿,14例混合型蛋白尿。
2.2 31例肾活检尿蛋白电泳结果
见表2。
3 讨论
生理性蛋白尿:生理条件下,尿蛋白含量很低,通常低于150mg/24h,男女之间无明显差异,主要是白蛋白条带或无条带。
肾小球性蛋白尿:尿蛋白其特征为:分子量>65-70KD(如白蛋白,转铁蛋白和Ig G),电泳条带显示位置在样本加样点与白蛋白部分之间,白蛋白是其主要成分。
肾小管性蛋白尿:其蛋白特征为:分子量<65-70KD,电泳条带位于白蛋白和凝胶片阳极端之间,如a1微球蛋白,游离轻链单体,RBP,溶菌酶。
混合型蛋白尿:其蛋白特征为低分子,高分子和白蛋白为主要蛋白区带,见于重症肾炎及肾功能不全,尿毒症等。
本院134例住院肾病患者仅3例显示生理性蛋白尿,其余131例均有病理性成分出现,显示出尿电泳对肾脏病损伤有着极高的敏感性。31例经肾脏活检病理确诊的患者尿样标本中,27例中、大分子型蛋白尿肾病患者与肾小球病变的肾活检一致;3例混合性蛋白尿肾病患者中与肾活检的肾小管、肾小球均发生病变基本一致。1例小分子型蛋白尿肾病患者与肾活检的肾小管病变一致,可见,尿蛋白电泳与肾活检结果基本一致[2,3]。
相对于肾活检来说,尿蛋白电泳具有取材简便,无创伤性,灵敏度和特异性高等优点,对患者无任何伤害。通过尿蛋白电泳的典型特异性图谱做快速诊断[4],即减轻了患者的痛苦,又可以为临床医师提供可靠的理论依据,随着电泳技术的改革创新,其必将在未来的肾脏诊断中担负起不可轻视的作用。
参考文献
[1]Corso A,Serricchio G,Zappasodi P,et al.Assessment of renal function in patients with multiple myeloma:The role of urinary proteins[J].Ann Hematol,1999,78(8):371-375.
[2]沈霞,张敏华,汪萍,等.非浓缩尿蛋白电泳的临床应用[J].中华检验医学杂志,2001:24(5):266-268.
[3]赵驻军,郭洪海,李亚.非浓缩尿蛋白电泳在肾脏疾病诊断中的应用价值[J].临床荟萃,2006,21(14):1045-1046.
尿蛋白电泳 第4篇
关键词：尿圆盘电泳,尿免疫固定电泳,肾脏疾病诊断,作用分析
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取2007年10月至2009年12月间我院收治的80例肾脏疾病患者, 将其分成观察组和对照组2组。对照组采用尿圆盘电泳检测, 观察组采用尿免疫固定电泳检测。80例患者中男33例, 女47例, 年龄在6~74岁之间。所有患者均经临床、检验以及各类肾功能、影像、手术等确诊。2组患者在年龄、性别病历上无差异性。
1.2 仪器与试剂
应用美国Helena Laboratories公司REPⅡ和spife2000电泳仪。尿圆盘电泳和尿免疫固定电泳均采用配套试剂, 操作按该公司操作技术常规。
1.3 研究方法
对照组收取患者均采取100m L的晨尿, 并对其细胞和组织碎屑进行过滤。对于定性在“+”或者蛋白浓度在500mg/L以上的尿液选取为样本[1]。在4℃的冰箱中保存。观察组, 选晨尿100m L, 保存环境为2~6℃的环境下保存3d。避免对样本的反复冻融, 使得免疫球蛋白的结构发生变化。
1.4 统计学方法
本组数据采用SPSS 13.0统计学软件进行处理, 计量资料以x-±s表示, 组间进行t配对检验, 计数资料进行χ2检验, 均以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
对照组80例患者中59例患者为高、中分子蛋白尿, 临床均诊断有肾小球病变, 10例患者为低分子, 临床诊断有肾小管及间质病变, 5例为混合型蛋白尿, 临床诊断肾小球、肾小管及间质等病变, 6例为正常类型或者微量低分子蛋白尿, 均属治疗后恢复者。观察组用免疫固定电泳法测定, 结果有20例患者呈阳性, 属K型的有12例 (60%) , 入型的有8例 (40%) 。
3 讨论
肾脏是人体重要的排泄器官, 正常情况下, 肾小球滤过膜能够有效阻止相对分子质量在4000以上的蛋白质通过。虽然相对分子量<4000的低分子蛋白质能够通过滤过膜, 但以后又被近曲小管重吸收[2]。通过对80例患者尿圆盘电泳的分析, 我们可以判断反应肾小球病变的高、中分子蛋白尿可见于肾病综合征、紫瘫肾、各型肾小球肾炎、慢性肾炎氮质血症等7种类型肾脏病。反应肾小及间质病变的低分子蛋白尿可见于慢性肾盂肾炎、肾小管酸中毒、间质性肾炎、肾移植后慢性排异反应等4种类型肾脏病, 混合性蛋白尿则多见于肾病综合征, 病变波及小球、小管及间质, 或后期的氮质血症阶段。凡有高分子、中分子或低分子蛋白尿者, 可以估计患者是否尚未痊愈、缓解或还有隐性病变, 由此来决定是否应继续治疗[3]。
80例患者利用琼脂糖凝胶电泳的免疫固定法进行检测, 其具有的特异性和高灵敏度作为测定本.周氏蛋白方法而应受到推荐。由于浓缩的方法目前没有标准化的方法, 因此, 本实验对非浓缩的晨尿进行检测, 尿免疫固定电泳对于尿样的标本要求也比较一般, 取样应以24h尿标本或晨尿标本, 如果对尿液浓缩后进行电泳, 则能更好的提高其检测的灵敏度。结果表明非浓缩样本对80例肾脏疾病患者有良好的灵敏度和特异性。
尿圆盘电泳的检测方法受到越来越多人的重视。由于圆盘电泳检出最小敏感限度为15mg/L, 再加上该法采用的染色液敏感性高, 尿液不需预先浓缩, 可直接进行检测, 大大缩短了实验时间。因此, 在以后的检测中圆盘电泳将越来越多的被普及。正常人尿蛋白的特征为在白蛋白区带上下两侧, 从高分子到低分子都有蛋白区带分布, 白蛋白为单独的重要组成部分, 但并不突出;低分子量主要区带在白蛋白及白蛋白以下;中分子量和高分子量主要区带在白蛋白及白蛋白以上;混合性尿蛋白的特征为低分子加高分子, 白蛋白带为主要区带。
圆盘电泳的原理是利用琼脂糖凝胶的选择性成分及多孔性以及蛋白质的分子量多少, 将尿蛋白分为混合分子型、大分子型、中分子型、小分子型这四类。而且电泳能区分出各种蛋白成份, 在肾损伤的诊治过程中, 对病情的动态分析有很大价值。病理检查难免出现些不稳定因素, 利用尿蛋白电泳结果观察患者的电泳图谱是否出现异常的蛋白带作为筛查, 其结果的判断存在不确定的因素, 而且仍需要免疫固定电泳做进一步的确定。
参考文献
[1]赵驻军.非浓缩尿蛋白电泳在肾脏疾病诊断中的应用价值[J].临床荟萃, 2006, 21 (14) :167～145.
[2]廖慧芳.免疫固定技术检测尿本-周蛋白及其临床分析[J].海南医学, 2006, 17 (10) :70～21.
[3]林敏.尿微量蛋白检测及尿蛋白电泳在肾脏疾病诊断中的应用[J].放射免疫学杂志, 2006, 19 (6) :211～157.
艾滋病人血清蛋白电泳结果分析 第5篇
1资料与方法
1.1 一般资料
选取我院住院艾滋病人87例, 均有不同程度的并发症, 年龄23～71岁, 平均年龄 (38±20) 岁, 其中男性52例, 女性35例;HIV感染但无症状携带者35例, 年龄25～65岁, 平均年龄 (35±18) 岁, 其中男性18例, 女性17例;健康体检者30例, 年龄27～78岁, 平均年龄 (39±22) 岁, 其中男性17例, 女性13例。对照组排除免疫系统、血液系统等疾病。
1.2 仪器
使用法国Sebia HYDRASYS全自动电泳仪进行电泳分离、染色、脱色和干燥等步骤, 然后用光密度扫描仪扫描凝胶片, 用Sebia EPSON公司配套软件分析。
1.3 标本要求
所有受试者均清晨空腹采血3ml。
1.4 统计学处理
计量资料用
2结果
正常组与携带者组差异无显著性 (P>0.05) ;艾滋病组ALB低于正常组有显著性差异 (P<0.01) , 艾滋病组α1、β、γ高于正常组有显著性差异 (P<0.01) , α2与正常组无统计学意义。见表1。
注:对照组与艾滋病组及携带者组比较*P<0.01, △P>0.05。
3讨论
琼脂糖血清蛋白电泳根据不同蛋白的等电点不同产生电泳作用, 具有分子筛选的效果, 小分子比大分子跑得快而使分辨率提高[1] , 实验室常用的琼脂糖凝胶电泳技术可将血清蛋白分为白蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白5个区带, 每个区带都含有1种或多种蛋白质成分[2]。α1球蛋白区是以α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶为主的区带;α2球蛋白区带是由触珠蛋白、α2巨球蛋白、铜蓝蛋白、α脂蛋白等组成;β球蛋白区带是由转铁蛋白、β脂蛋白、C3补体、纤溶酶原等组成;γ球蛋白主要是免疫球蛋白组成的区带, 包括IgG、IgA、IgM抗体等[3], 本文中艾滋病毒携带者血清蛋白电泳结果与正常人无差异, 表明艾滋病携带者的细胞免疫受损, 但未伤及其体液免疫, 艾滋病人的血清白蛋白显著低于正常人, γ球蛋白显著高于正常人, 与陈俊梅等[4]研究一致, 一般认为随着病情的进展, 患者免疫力不断下降。机体的免疫作用以T淋巴细胞的细胞免疫作用最为重要, T淋巴细胞功能缺陷, 免疫监护能力降低, 故B淋巴细胞功能反而增强, 形成抗体增多, γ球蛋白增多, 对艾滋病人血清蛋白电泳的观察, 对于判断病情、治疗效果和预后的估计有重要意义。
参考文献
[1]张秀明, 李健斋, 魏明竟, 等.现代医学生化检验学 (M) .北京:人民军医出版社, 2001:1179-1184.
[2]周燕.蛋白电泳的测定方法及在肝脏疾病中的诊断价值 (J) .山西医药杂志, 2003, 32 (5) :574.
[3]周爱儒.生物化学 (M) .第5版.北京:人民卫生出版社, 2001:365.
尿蛋白电泳 第6篇
关键词：孜然芹,贮藏蛋白,含量,清蛋白,电泳
孜然, 学名孜然芹 (Cuminum cyminum L.) , 又名枯茗、安息茴香, 属伞形科孜然芹属, 一年生草本植物, 主要产于西班牙、摩洛哥、阿根廷、俄罗斯、埃及、埃塞俄比亚、地中海一带以及我国的新疆地区和甘肃河西走廊。新疆是我国孜然芹的最主要的传统产地, 据统计, 截止到2005年新疆已播种孜然芹近70余万亩, 占全国种植总面积的90%以上, 总产量约4.2万t。
种子中的蛋白质组分是基因表达的产物, 记录了物种在发育过程中的亲缘关系以及种间与品种间的遗传差异。本研究旨在利用种子贮藏蛋白的多样性及电泳技术, 对我国孜然芹地方品种的种子贮藏蛋白组分进行研究, 找出孜然芹种子纯度鉴定的适宜目标蛋白, 研究孜然芹种子蛋白质的多态性, 分析我国孜然芹品种间的亲缘关系, 为科学保护和充分利用我国孜然芹地方品种资源及孜然芹育种研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料见表1。
1.2 方法
1.2.1 样品制备
1.2.1. 1 孜然芹种子蛋白含量测定的样品制备
采用蛋白质连续累进方法提取种子蛋白。具体方法如下:将风干净孜然芹种子研磨并过60目筛, 称取孜然芹种子粉1.00 g于瓷研钵中, 加少量水研磨至匀浆, 转入离心管中, 放入50℃恒温振荡水浴摇床, 振荡提取30 min, 以4 000 r/min离心取上清液, 用蒸馏水再洗残渣2次, 重复以上提取过程, 合并上清液50 m L作为水溶蛋白 (清蛋白) ;在沉淀中再添加10% (w/v) 氯化钠, 重复提取过程, 上清液为盐溶蛋白 (球蛋白) ;在沉淀中再添加75%的乙醇, 重复提取过程, 获得醇溶蛋白;剩余的沉淀中加入0.2% (w/v) 氢氧化钠溶液, 重复提取过程, 获得碱溶蛋白质 (谷蛋白) 。
上述提取液分别吸取一定量的体积, 用自动凯氏定氮仪测定各组分蛋白质含量。每个样品重复两次。
1.2.1. 2 孜然芹种子电泳样品制备
A.孜然芹种子四种贮藏蛋白样品制备:取单粒种子, 粉碎后加入100μL蒸馏水混匀, 60℃提取1 h, 离心取上清液, 作为清蛋白;在沉淀中再添加100μL蒸馏水重复上述过程2次, 离心弃去上清液, 在沉淀中依次添加2.5% (w/v) Na CL、70%的乙醇 (含1%的巯基乙醇) 、0.2% (w/v) 氢氧化钠溶液, 重复上述提取过程, 分别获得盐溶蛋白 (球蛋白) 、醇溶蛋白、碱溶蛋白质 (谷蛋白) 。提取的各种蛋白质溶液用调整液 (20%冰醋酸、6%尿素和10%TEMED) 调整混匀, 10 000 r/min离心后用于电泳分析。
B.孜然芹品种间清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳样品制备:随机取10个孜然芹品种单粒种子分别粉碎, 每粒加入80μL的清蛋白提取液提取2 h, 5 000 r/min离心15 min, 取上清液进行电泳检测。
1.2.2 蛋白含量测定
采用自动凯氏定氮仪测定每个组分蛋白质含量, 每个样品重复两次。
1.2.3 电泳
本实验使用BIO RAD公司的POWER PAC1000型电泳仪和垂直板电泳槽, A试验参照颜启传醋酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法, 分离胶浓度10.0%, 在4℃环境下电泳分离。B试验采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶和浓缩胶的浓度分别为7.0%和2.5%, 用微量进样器在样品槽内加样品提取液各15μL。初始电压120 V稳压约15 min, 电压调为200 V稳压约50 min, 待指示剂到达底部时停止电泳。
1.2.4 固定和染色
电泳完成后取出胶片, 放入100 m L 12.5% (W/V) 的三氯乙酸和2~3 m L 2%考马斯亮兰R250的混合染色液中固定染色。待谱带清晰后用蒸馏水清洗干净, 放入10%的醋酸脱色液中脱色直到背景清晰, 照相、扫描或制干胶保存。
2 结果与分析
2.1 孜然芹种子贮藏蛋白组分含量之间的关系
采用蛋白质连续累进方法提取的5个孜然芹种子贮藏蛋白组分 (清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白) 含量见表2。
由表2可以看出, 同一孜然芹种子贮藏蛋白各组分含量有明显差异。清蛋白最高, 为种子干重的7.14%~8.99%;其次是球蛋白和谷蛋白, 球蛋白含量为种子干重的2.14%~3.18%, 谷蛋白含量为种子干重的1.47%~1.98%;醇溶蛋白含量最低, 为种子干重的0.34%~0.53%。各组分平均值的排列顺序为:清蛋白>球蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。
从不同孜然芹品种来看, 四种提取蛋白组分中, 清蛋白含量最高的为新孜然2号种子, 球蛋白含量最高的为孜然 (农大) 种子, 谷蛋白含量最高的为粮 (引) 孜然种子, 醇溶蛋白含量最高的则为孜然 (喀什) 种子。总蛋白含量最高的为孜然 (农大) 种子, 最低的是新孜然1号种子。总蛋白含量相差也不大, 含量最高的14.19%, 最低的11.35%, 变异系数0.03。各品种间4种贮藏蛋白含量的标准差及变异系数较小, 均<1, 差异不大。
2.2 孜然芹种子4种贮藏蛋白电泳
从图1可以看出, 5种孜然芹种子的清蛋白电泳图谱清晰可见, 谱带数目较多, 有7条, 但品种间没有特异性谱带, 不能区分品种之间的差异。孜然芹种子醇溶蛋白电泳图谱与清蛋白图谱中谱带数目相差不大, 但是电泳图谱较浅, 可能由于孜然芹种子较小而且醇溶蛋白含量较低, 从而引起某些谱带丢失。孜然芹种子球蛋白和谷蛋白电泳图谱的谱带数目最少, 电泳结果差, 无法分析。
[注:泳道从左到右:1、2、3新孜然1号, 4、5、6粮引孜然, 7、8、新孜然2号, 9、10孜然 (农大) , 11、12孜然 (喀什) ]
2.3 孜然芹品种间清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
由图2可看出, 供试的10个孜然芹种子样品谱带较丰富, 均有Rf值0.11、0.26、0.33、0.44、0.53、0.60、0.64、0.71、0.82的9条带, 只有2号种子 (粮引孜然) 多一条Rf值为0.68的谱带。对于其他9个样品, 在同一试验条件下不同品种之间电泳谱带均一样, 只是在强弱上有一定的差异, 表明利用孜然芹种子的清蛋白电泳图谱能将引种孜然芹与其他9个孜然芹样品区分来, 但是不能将所有孜然芹品种彼此很好的区分。
3 讨论与结论
孜然芹种子4种贮藏蛋白, 清蛋白含量最高, 其次是球蛋白和谷蛋白, 醇溶蛋白最低。孜然芹种子5个品种的贮藏蛋白各组分之间相对种子干重的百分含量差异不明显, 标准差和变异系数均<1, 而且总蛋白含量差别不大。根据蛋白含量高低及4种贮藏蛋白的电泳图谱分析, 首先选用清蛋白作为孜然芹种子蛋白电泳技术研究的对象。
孜然芹种子清蛋白在种子贮藏蛋白中含量丰富, 其电泳图谱也反映出清蛋白具有较好的多态性。但是孜然芹种子目前只有2个通过新疆地方审定的品种, 都是通过长期的自然选育而成的农家品种, 其他国内品种也主要集中在新疆及河西走廊一带, 导致品种间差异不大, 亲缘关系较近, 仅仅利用清蛋白电泳技术是无法很好的鉴定国内现有孜然芹农家品种的纯度和真实性的。但是, 随着国外引种、航天育种及分子生物技术在孜然芹育种中的应用, 孜然芹品种资源已经在向多样化发展, 本试验中采用孜然芹清蛋白电泳技术找出了引种孜然芹区别于其他国内9个孜然芹种子的特异性电泳谱带, 可见利用清蛋白电泳技术快速鉴定孜然芹品种的真实性和纯度具有一定的可行性。
参考文献
[1]颜启传, 黄亚军.农作物品种鉴定手册[M].北京:中国农业出版社, 1994.
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小麦中水溶性蛋白质的电泳分析试验 第7篇
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试小麦品种。
供试小麦品种为豫麦19、周麦16、9023 (麦) 、温麦19、温麦6号、温麦8号、豫麦20、9133 (麦) 、温麦4号、91 (麦) 等10种, 由种子公司提供。
1.1.2 试验仪器。
供试仪器为DYY-11B型三恒电仪, DYC-28A型垂直电槽, 由北京市广六一仪器厂生产;离心机LG16-W, 由北京医用离心机厂生产;电子天平stariousBS210, d=0.0001 g。
1.1.3 试验试剂。
供试试剂为丙烯酰胺 (Acr) , AR.三羟甲基氨基甲烷 (Tris) , AR.N, N-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis) , AR.甘氨酸 (Gly) , BR.十二烷基苯磺酸钠 (SDS) , AR.考马斯亮蓝R, AR.溴酚蓝.N, N, N’, N’—四甲基乙二胺 (TEMED) , AR.巯基乙醇, C·P·.过硫酸铵 (AP) , AR.盐酸, AR·甲醇、冰乙酸、琼脂糖、双蒸水。
1.2 试验方法
1.2.1 溶液配制。
30%分离胶贮液的配制:称丙烯酰胺30 g, 及甲叉双丙烯酰胺0.8 g, 溶于双蒸水中, 最后定容至100 mL, 过滤后置于棕色试剂瓶中, 4℃贮存。10%浓缩胶贮液的配制:称取丙烯酰胺10 g及甲叉双丙烯酰胺0.5 g, 溶于双蒸水中, 最后定容至100 mL, 过滤后置于棕色试剂瓶中, 4℃贮存。分离胶缓冲液的配制:称取Tris 36.3 g, 加入少许双蒸水使其溶解, 再加入HCl调节pH值至8.8, 最后加双蒸水定容至100 mL, 4℃贮存。浓缩胶缓冲液的配制:称取Tris 6 g, 加入少许双蒸水使其溶解, 再加HCl调节pH值至6.8, 最后加入双蒸水定容至100 mL, 4℃贮存。电极缓冲液的配制:称取Tris 3 g, 甘氨酸14.4 g, 加入10%SDS 10 mL, 加蒸馏水使其溶解后定容至1 000 mL。2%琼脂糖溶液的配制:称取琼脂糖4 g, 加入电极缓冲液100 mL, 加热使其溶解, 4℃贮存, 备用。3M Tris-HCl (pH值6.9) :称取Tris 7.24 g, 加入少许双蒸水使其溶解, 再加入HCl调节pH值至6.9, 最后加双蒸水定容至20 mL, 4℃贮存。固定液的配制:甲醇400 mL, 冰乙酸100 mL, 加水至1 L, 200 mL/块胶。染色液的配制:考马斯亮蓝0.25 g, 50%甲醇454 mL。脱色液的配制:冰乙酸75 mL, 水875 mL, 甲醇50 mL。样品提取液的配制:10%SDS 2 mL、巯基乙醇0.5 mL、溴酚蓝0.2 mL、甘油1 mL、3M Tris-HCl0.2 mL, 加双蒸水至总体积为10 mL;10%SDS 10 mL、巯基乙醇2.5 mL、溴酚蓝1 mL、甘油5 mL、3M Tris-HCl 1 mL, 加双蒸水至总体积50 mL。凝胶溶液的配制:浓度为15%, 分离胶贮液9.1 mL、分离胶缓冲液2.5 mL、10%SDS 0.2 mL、1%TEMED 2 mL、10%AP 0.13 mL, 加双蒸水至所需体积20 mL;浓度为3%mL, 浓缩胶贮液3 mL、浓缩胶缓冲液2.5 mL、10%SDS 0.1 mL、1%TEMED 1 mL、10%AP 0.88 mL, 加双蒸水至所需体积10 mL。
1.2.2 样品提取。
取单粒小麦种子, 去胚端, 置于1.5 mL的塑料离心管中, 用玻璃棒捣碎;加入双蒸水150μL混匀, 间隔涡旋2次, 室温静置1 h后离心, 于4℃、13 000 r/min离心10 min, 收集上清液;重复上面第2步2次, 将收集到的上清液集于一管中, 60℃真空干燥至只有微量液体剩余, 停止干燥, 加入样品提取液100μL, 涡旋, 2次, 室温静置1 h以上;使用前100℃水浴3 min, 然后室温下13 000 r/min离心3 min, 取上清液即可加样。
1.2.3 凝胶的配制及灌胶。
安装电泳槽:按照说明书中的方法将事先清洗好的电部件安装好, 并用10%的琼脂糖溶液把连接部分封好, 以防止漏液。制胶:此过程要迅速, 按1.2.1中凝胶溶液的浓度, 先制分离胶, 然后迅速用吸管将其加入胶室中, 距玻璃板上端约4 cm时停止, 可加入少量水以除去气泡, 静置30 min左右, 当水面下出现1条折射线时说明胶已经凝固, 将水用滤纸吸出, 把梳子插入2个板中间, 加入浓缩胶。
1.2.4 加样。
取出梳子, 在电泳槽中加入电极缓冲液, 阴极端液面应高出玻璃板, 但总液面不能高过阳极板面。用微量注射器吸取样品液10μL, 加入加样孔中, 重复10次, 记住加样顺序。
1.2.5 电泳。
连接好电泳仪, 调好电流在30 mA, 恒流电泳到指示剂下端0.5 cm时停止电泳。
1.2.6 固定、染色和脱色。
电泳结束后, 取出硅胶框, 并取出玻璃板, 用不锈钢刀片插入玻璃板的连接处, 让刀片从一端慢慢划到另一端, 两面三刀板可自然分开, 在凝胶下端处用刀切一下小角作标记 (在两侧溴酚蓝区带的中心插入铜丝作为记号) , 放入固定液中固定30 min, 然后再放入染色液中染色45 min, 之后再放入脱色液中脱色到蛋白质条带清晰即可。为了加快染色和脱色过程的速度可将凝胶放在振荡。1.2.7制干胶。将凝胶和2张玻璃纸 (比玻璃板四周宽3～5 cm) 浸泡在保存液 (25%乙醇, 10%乙酸, 1%～5%甘油水溶液) 中10～20 min, 将一张玻璃纸平铺在一块比凝胶略大的玻璃板上 (可用玻璃棒赶走玻璃纸与玻璃板之间的气泡) , 然后将凝胶平铺在玻璃纸上, 将另一块玻璃纸覆盖在凝胶上, 其间不能有气泡, 将2层玻璃纸多出玻璃板的部分折向玻璃板底部, 用另一块同样大小的玻璃板压住, 再用夹子夹住, 两端固定, 室温下避光放置1 d左右取下玻璃板, 即可得到透明的干胶, 可长期保存。
2 结果与分析
用SDS-PAGE方法对10个不同小麦品种进行电泳分析, 结果见图1。
注:1为豫麦19;2为周麦16;3为9023 (麦) ;4为温麦19;5为温麦6号;6为温麦8号;7为豫麦20;8为9133 (麦) ;9为温麦4号;10为91 (麦) 。
从图1可以看出, 不同小麦品种的水溶性蛋白电泳图谱存在明显的差异, 尤其是在数目、迁移率及谱带的强度方面的差异较明显, 说明不同小麦品种的水溶性蛋白的电泳图谱不同。基于品种间水溶性蛋白的电泳谱带存在差异, 因此笔者认为小麦水溶性蛋白可以用作小麦品种鉴定。这与Galdwell et cn[15]、卞科等的研究结果相同。同时, 虽然可以肯定水溶性蛋白在植物体内的合成是受基因控制的, 但尚不明确该种合成是否受外境因素的影响, 相关研究也较少, 尚需进一步研究[16]。
3 结论与讨论
元江鲤与建鲤血清转铁蛋白电泳分析 第8篇
1材料与方法
1.1试验用鱼来源及处理元江鲤来源于云南省元江县元江鲤原种场, 平均体重0.3 kg, 体长12 cm;建鲤来源于中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 平均体重1.2 kg, 体长25 cm。2种鱼均为雄鱼, 年龄为2龄。从活鱼的尾柄部侧线处取血1 m L左右, 4℃下4 000 r/min离心20 min, 取上清液分装于试管中, -20℃下保存备用。
1.2主要仪器和药品电泳仪 (DYY—4型稳压稳流电泳仪) 、电泳槽 (DYCZ—22A型电泳槽) 、丙烯酰胺单体贮液、分离胶缓冲液贮液、浓缩胶缓冲液贮液、电极缓冲液、0.005 mol/L Tris-Hcl、0.4%伊凡诺、0.1%考马斯亮蓝、5%固定液, 药品均为分析纯。
1.3样品制备将血清纯化后电泳, 电泳结束后用0.1%考马斯亮蓝溶液进行染色, 最后用脱色液脱色直至底板颜色褪尽谱带清晰。
1.4凝胶及缓冲液配制分离胶和浓缩胶系统分别按表1[2,3]、表2[2~5]中的配方严格进行配制。
1.5数据处理采用伊凡诺纯化的方法, 使得血清蛋白的多组成分被离心去除, 因此伊凡诺纯化后的血清其主要成分认为就是Tf。2种鲤鱼的Tf样品经8%不连续PAGE分离展现出清晰的谱带, 均出现3个区域, 而中间区域的电泳图谱却不尽相同。将具有相同Tf电泳表型的个体鉴定为同一品系, 不同Tf表型的个体认为是不同的品系。等位基因命名依其电泳迁移速度的大小, 从阳极到阴极依次用小写字母a、b、c、……表示。
2试验结果
2.1元江鲤的血清转铁蛋白电泳结果10尾元江鲤的血清纯化的转铁蛋白电泳结果中分析鉴定出5种Tf表型 (见图1) , 有Tfa、Tfb、Tfc、Tfd、Tfe5个等位基因, 其中显示3条带的3种表型Tfabc、Tfabd、Tfbce;显示4条带的1种表型Tfabcd;显示2条带的1种表型Tfbc。
2.2建鲤的血清转铁蛋白电泳结果10尾建鲤的血清纯化的转铁蛋白电泳结果中分析鉴定出5种Tf表型 (见图2) , 有Tfa、Tfb、Tfc、Tfd4个等位基因, 其中显示3条带的1种表型Tfbcd;显示2条带的4种表型Tfab、Tfac、Tfbc、Tfbd。
3讨论分析
3.1元江鲤种内Tf表型差异分析10尾元江鲤的血清纯化的转铁蛋白电泳结果中显示3条带表达量最高, 同时Tfa、Tfb、Tfc3个等位基因的频率最高, 可以初步推断Tfa、Tfb、Tfc这3个等位基因是原始基因。其他基因可能是在自然选择中由于基因频率的随机变动, 出现蛋白质的过渡性多态现象或者是变异而来[6]。
3.2建鲤种内Tf表型差异分析10尾建鲤的血清纯化的转铁蛋白电泳结果中显示2条带表达量最高, 同时Tfa、Tfb、Tfc3个等位基因的频率最高, 可以初步推断Tfa、Tfb、Tfc这3个等位基因是原始基因。其他基因可能是在自然选择中由于基因频率的随机变动, 出现蛋白质的过渡性多态现象或者是变异而来[6]。
3.3 2种鲤鱼种间Tf表型差异分析通过PAGE电泳结果发现, 在随机各自抽取的10尾鲤鱼中, Tf表型和基因型存在一定的差异, 而且等位基因的表达强弱也因品种的不同而呈现差异现象。表型的多样性很可能是由于等位基因的不同引起的, 也可能是血清的活性强弱、颜色浓淡及迁移率不尽相同, 具有组织特异性的原因, 或者是种内生化遗传特征和种质纯度不尽相同所致。元江鲤和建鲤Tf表型均由Tfa、Tfb、Tfc3个等位基因决定, 即为共同显示的优势等位基因, 这可能是由于建鲤是以特定的荷包红鲤和元江鲤为亲本, 采用家鱼选育、系间杂交及染色体组工程 (雌核发育) 等综合育种的新工艺, 经6代定向选育育成的良种所导致的具有一定的亲缘关系。
4结论
试验结果使我们对2种鲤鱼种内、种间生化遗传特征和种质纯度有了初步了解, 并初步建立了这2种鲤鱼的父本血清转铁蛋白图谱库。但本试验所采用的鱼都是雄鱼而且数量有限, 如果用于试验的鱼数量足够多, 电泳设计更加合理, 可能会发现更多品系和更为明显差异。作为基因表达的产物, 血清转铁蛋白PAGE图谱的差异在某种程度上可以反映物种遗传基础上的差异, 但鱼类血清转铁蛋白中多数性状是由多个基因控制, 用电泳技术能检测出的基因差异目前还在少数, 因此在生化遗传学上的差异以及这些差异的稳定性尚有待进一步深入研究。
摘要：采用聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳法 (PAGE) 对元江鲤 (Cyprinus carpio yuankiang) 和建鲤 (Cyprinus carpio Jian) 血清转铁蛋白进行初步探究, 通过分析和比较2种鲤鱼种内、种间血清转铁蛋白电泳表型差异, 以了解这2种鲤鱼种内、种间生化遗传特征和种质纯度。结果:在随机各自抽取的10尾鱼中, 表型有所不同, 个体间有差异, 进一步分析分别鉴定出元江鲤有5个品系, 建鲤有5个品系;分析2种鲤鱼转铁蛋白多态性的等位基因及其基因频率。结果表明:元江鲤与建鲤的亲缘关系较近, 但2种鲤鱼在转铁蛋白表型上还是存在一定差异。
关键词：鲤鱼,转铁蛋白,电泳分析
参考文献
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