酶化学法范文
酶化学法范文（精选8篇）
酶化学法 第1篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
我院在体检中心随机抽取60例血糖正常志愿者, 年龄21～72 (平均53.2±9.2) 岁, 空腹血糖<6.1mmol/L, 餐后2h血糖<7.8mmol/L。在体检中心随机选取空腹血糖 (FPG) 为6.1～7.0mmol/L或者餐后2h血糖 (2hPG) 为7.8～11.1mmol/L的志愿者共30例, 年龄为23～67 (平均55.3±8.4) 岁。在我院内分泌科随机选取糖尿病患者共60例, 年龄为28～74 (平均56.4±9.4) 岁。三组志愿者经过体检无严重肝、肾疾病, 其他如年龄、性别等无统计学差异 (P>0.05) 。
1.2 仪器和试剂
Beckman Coulter AU480全自动生化分析仪、德国西门子HbA1c免疫法专用仪器DC2000, 日本TOSOH公司生产的自动糖化血红蛋白分析仪。金斯尔试剂;溶血剂, CHES缓冲剂, 还原剂;糖化血红蛋白试剂:蛋白酶、R1a MES缓冲液、R1b缓冲液、R2FVO酶、还原剂;显色剂;辣根过氧化酶等。
1.3 检测原理
酶化学法可以直接测定样本中的糖化血红蛋白的百分比, 经过处理的样本在氧化还原反应后可除去相关干扰物质, 血样本经蛋白酶分解产生氨基酸, 糖化血红蛋白可以结合缬氨酸作为果糖缬氨酸的底物, 经过反应产生H2O2 , H2O2经过氧化物酶分解作用可与显色剂发生反应并显色, 测定吸光度求出糖化血红蛋白的浓度。
1.4 检测方法
用真空采血管采集三组志愿者静脉血, 并做好相关处理及溶血标本, 依据试剂盒提供的操作步骤, 调配好试剂, 预计好波长, 在自动生化分析仪上设置好参数和监控程序, 由仪器自动完成检测。对检测结果进行记录。
1.5 统计学处理
在本临床研究中所有数据均采用SPSS 13.0统计软件, 所有计量资料均用表示, 计量资料采用两组独立样本t检验, 计数资料采用卡方检验, 对其他数据采用相关分析和线性回归等统计方法。
2 结果
2.1 酶化学法HbAlc的精密度试验结果
对三组不同血糖浓度志愿者进行酶法测定, 结果见表1。结果显示批内变异系数 (批内CV) 为0.7%～1.3%。 批间变异系数 (批间CV) 为1.1%～2.2%, 精密度良好。
2.2 稀释
取糖尿病组待测标本, 用生理盐水稀释, 分别将待测样本稀释为0.8、0.6、0.4、0.2、0.1倍共5份样本, 进行HbAlc的测定, 结果显示Y=1.0489X-0.1249, 相关系数r=0.9993, 说明稀释直线线性良好。
2.3 三组不同血糖志愿者进行HbAlc, FPG、2hPG结果
见表2。结果显示三组间HbA1c, FPG、2hPG差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
糖化血红蛋白是葡萄糖和血红蛋白通过酶促反应结合而成的一种物质, HbA1c是糖化血红蛋白的一个亚型, 具有显著的特征, 可作为评估血糖2～3个月内的控制情况[2], 为实验室诊断提供了一个可靠而且准确的方法, 是监测糖尿病长期血糖水平的标准。有文献报道, 酶化学反应法测定HbA1c有着突出的优点, 特异性高、相关性好、方便快捷、结果准确[3]。随着实验室诊断技术的发展, 对糖尿病等诊治的要求也越来越高, 酶化学法在临床应用中有着广阔的前景。本文就三组不同血糖浓度志愿者进行了HbA1c的酶化学法测量, 结果显示批内CV为1%左右, 批间CV为1.5%左右, 表明酶化学法的精密度良好。对稀释的高值样品进行测量并做线性回归, 测定相关系数r=0.9993, 表明酶化学法的直线线性相关性强。另外三组不同血糖志愿者进行HbAlc, FPG、2hPG的测定结果显示三组有显著性差异 (P<0.05) 。
综上所述, 酶化学法在测定HbAlc中精密度良好, 为实验室检查提供了准确可靠的数据, 可为糖尿病的诊治提供可靠的诊断指标, 在糖尿病的长期监测中有着重要的意义。
摘要：目的 探讨酶化学法对糖化血红蛋白性能的检验作用。方法 取体检中心60例血糖正常、30例临界血糖志愿者以及60例糖尿病患者进行HbA1c酶化学法的测量并做分析。结果 HbA1c批内CV为0.7%～1.3%, 批间CV为1.1%～2.2%, 相关系数r=0.9993, 3组HbAlc、FPG、2hPG水平有统计学差异 (P<0.05) 。结论 酶化学法测定HbA1c的准确度高, 线性良好, 在糖尿病的长期监测中有着重要的意义。
关键词：酶化学法,糖化血红蛋白,检验,糖尿病
参考文献
[1]薛声能, 程桦.糖化血红蛋白的研究进展[J].国际内科学杂志, 2008, 35 (10) :586.
[2]张长礼.免疫凝集法测定糖化血红蛋白[J].安徽卫生职业技术学院学报, 2008, 7 (5) :75。
5.1降低化学反应活化能的酶教案 第2篇
第1节 降低化学反应活化能的酶
一、教学目标
1、知识与技能目标
（1）说出细胞代谢的概念。
（2）说明酶在细胞代谢中的作用。
2、过程与方法目标
（1）通过有关的实验和探索，学会控制自变量，观察和检测因变量的变化，及设置对照组和重复实验
（2）提高学生观察、分析、判断的思维能力，提高学生的实验操作能力。
3、情感态度与价值观目标
（1）通过有关的实验和探索使学生体验实验成功的喜悦，并通过教师的引导使学生领悟科学实验的基本方法。
（2）培养学生的探索精神和合作意识。
二、教学重点和难点
1、教学重点（1）酶的作用
（2）控制变量的科学方法
2、教学难点
（1）酶降低化学反应活化能的原理（2）控制变量的科学方法
三、教学过程
1、导入
学习细胞器时，我们了解到在很多细胞器上都发生着化学反应。细胞产生能量、合成养料以及进行自我更新等等生理活动，都完全依赖细胞内发生的生物化学反应。细胞内全部的化学反应的总称就是细胞代谢。细胞内每时每刻都在进行着化学反应，这些反应如何能够高效地进行呢？那是因为有催化剂的存在。但是很多化学反应往往需要高温高压的条件，但生物体内是一个常温常压的状态，如何解决这个矛盾呢？就需要一种特殊的催化剂。酶就是生物体内的催化剂。
让我们结合资料看看科学家是如何发现酶的存在的。介绍教材P78斯帕兰扎尼的实验： 1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼将肉块放入小巧的金属笼内，然后让鹰把小笼子吞下。过一段时间后，把小笼子取出，发现肉快消失了。引导学生分组讨论如下问题：（请学生讨论并展示，教师予以解释和评价）1.为何要将肉块放在笼子中？（排除了胃对肉块的物理性消化。）
2.对肉起消化作用的是什么物质？（一定是某种物质进入到笼子中，使肉分解。）3.在实验室中能否也让肉分解？能的话需要怎样的条件？（能。需要高温、高压、强酸或强碱等剧烈条件。）
当时斯帕兰扎尼做过这个实验后他并不清楚起消化作用的物质是什么，但他的研究却为人们研究提供了方法和思路。1836年，德国科学家施旺从胃液中提取出了消化蛋白质的物质，解开胃的消化之谜。这种物质就是酶。本节课我们先来学习酶的作用与本质，请大家注意思考本节聚焦的重点问题。
2、展示
分小组展示学案中[阅读要求及检测]部分，检验学生阅读课本及预习的效果，教师给予
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评价。
3、要点与典型例题精讲
一、酶在细胞代谢中的作用
细胞中每时每刻都进行着许多化学反应，统称为细胞代谢。我们书上举了一个例子来说明酶的作用和作用特点。那就是对过氧化氢这种物质的分解。人体的新陈代谢除了生成人体需要的物质，也会有一些对人体有害的副产品产生，比如水系化合物在氧化时会产生过氧化氢。过氧化氢H2O2俗称？（双氧水）过氧化氢是一种强氧化剂，在人体内堆积的话会造成DNA损伤，并且加速人体的衰老进程。
性质：过氧化氢可自发分解生成水和氧气 2 H2O2→ 2 H2O + O2
这个反应在自然条件下反应的比较缓慢，但细胞中具有的物质却可以加速这个反应。请学生仔细阅读78-79页实验内容（3min），思考以下问题并请学生回答。
(1)实验中比较过氧化氢在不同条件下的分解，这里的“不同条件”指哪些?（2号:90度水浴加热；3号:加入3%的氯化铁；4号:加入20%肝脏研磨液）
(2)自变量、因变量、无关变量各是什么?（自变量：实验过程中可以人为改变的变量。本实验中氯化铁溶液和肝脏研磨液。因变量：随着自变量的变化而变化的变量。本实验中过氧化氢分解速率。
无关变量：除自变量外，其他可能对实验结果造成影响的因素。加入试剂的量;实验室的温度;氯化铁和肝脏研磨液的新鲜程度等。无关变量是误差的产生根源，我们要尽量减少无关变量对实验的影响，因此尽量①所有用生物材料要相同②所用实验器具要相同③所用实验试剂要相同④所用处理方法要相同）
(2)为什么要设计四组实验，1号组有什么作用?（除了一个因素以外，其余因素都保持不变的实验叫做对照实验。四组实验符合对照实验的要求，其中1号就是对照组）
教师可在教室或实验室进行实验操作，学生注意观察不同的条件下，过氧化氢的分解速率如何。记录现象并进行讨论：
1、与1号试管相比，2号出现什么不同的现象?这一现象说明什么?（2号放出的气泡多，说明加热能促进过氧化氢的分解，提高反应速率。）
2、在细胞内能通过加热提高反应速率吗?（不能）3、3号和4号未经加热，也有大量气泡产生，这说明什么?（说明FeCl3中的Fe3+和新鲜肝脏中的过氧化氢酶都能加快过氧化氢分解的速率。）4、3号与4号相比，4号试管中的反应速率快?这说明什么?为什么说酶对于细胞内化学反应顺利进行至关重要?（说明过氧化氢酶的催化速率比Fe3+高效得多。细胞内每时每刻都在进行着化学反应，这些化学反应需要在常温、常压下进行，只有酶能够满足这样的要求进行催化，所以说酶对于细胞内化学反应的顺利进行至关重要。）
既然酶对于细胞内化学反应的顺利进行至关重要，为什么酶可以在常温常压下高效地催化化学反应进行呢？我们可以先了解加热促进反应的原理，加热促使过氧化氢分解是因为加热使过氧化氢分子得到能量，从常态转变为容易分解的活跃状态。分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量称为活化能。
过氧化氢酶促使过氧化氢分解并未供给过能量，而是降低了过氧化氢分解反应的活化能。推而广之，酶促使反应进行，原因是酶能够降低化学反应活化能。对于这句话的理解可以阅读第80页内容，注意图5-1和5-2。
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分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量。活化能越低，反应发生的速率越快。如果把发生化学反应比喻为驾驶汽车翻越一座高山，加温加压相当于加大油门，而催化剂则相当于帮司机找到一条穿山隧道。这就是催化剂所体现的优越性。而同无机催化剂相比，酶降低活化能的作用更显著，效率更高。
二、酶的本质
酶究竟是什么物质呢？我们现在已经知道了大多数的酶是蛋白质。但是酶的本质是怎样被揭示出来的呢？让我们共同来回顾这一段科学发展史。请阅读第81页资料分析，填写第82页基础题第一题。再尝试回答讨论中的5个问题。
1、巴斯德和李比希的观点各有什么积极意义？各有什么局限性？
（巴斯德认为发酵与活细胞有关是合理的，但是认为发酵是整个细胞而不是细胞中的某些物质在起作用是不正确的；李比希认为引起发酵的是细胞中的某些物质是合理的，但是认为这些物质只有在酵母细胞死亡并裂解后才能发挥作用是不正确的。）
2、科学发展过程中出现争论是正常的。试分析巴斯德和李比希之间出现争论的原因是什么，这一争论对后人进一步研究酶的本质起到了什么作用？
（巴斯德是微生物学家，特别强调生物体或细胞的作用；李比希是化学家，倾向于从化学的角度考虑问题。他们的争论促使后人把对酶的研究的目标集中在他们争论的焦点上，使科学研究更加有的放矢。）
3、从毕希纳德实验可以得出什么结论？
（毕希纳的实验说明，酵母细胞中的某些物质能够在酵母细胞破碎后继续起催化作用，就像在活酵母细胞中一样。）
4、萨姆纳历时9年才证明酶为蛋白质，你认为他成功的主要原因是什么？
（萨姆纳历时9年用正确的科学方法，坚持不懈、百折不挠的科学精神，将酶提纯出来。成功属于不畏艰苦的人。）
5、请给酶下一个完整的定义。
（来源、功能、化学本质。酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质，少数是RNA等。）
4、训练
请同学完成学案中[自主训练]的前6道选择题，并请每组派代表公布答案并给予简要解释。
5、总结
一、酶在细胞代谢中的作用
1、作用：催化化学反应
实验：比较过氧化氢在不同条件下的分解 控制变量：自变量 因变量 无关变量
2、原理：降低化学反应的活化能
二、酶的本质
1、对酶本质的探索历程
2、酶的本质：酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质，少数是RNA等。
6、作业
完成习题本中本节中的选择题必作题。
酶化学法 第3篇
【关键词】纳米通道；电化学单分子；酶分子
Abstract：Objective： To study the application value of the detection of the enzyme molecules by the electrochemical single molecule analysis of the nano channel. Methods： Analyze the affinity interaction between thrombin and thrombin reagent by using hemolysin and lecithin free assembly to biological nanopores through the characteristics of hemolysin aperture to control single stranded DNA and double stranded DNA. Results： The current signal was terminated because the double stranded structure which made up with cervical loop structure could not pass through the hemolysin nanopore. In addition， under high voltage， the structure of the neck ring was destroyed， and the DNA of the neck ring was ssDNA. Conclusion： There is no relationship between the DNA solution chain time and the double chain sequence of the structure of the neck ring， and the applied voltage is closely related.
Keywords：nano channel； electrochemical single molecule
【中图分类号】R-1 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2015）06-0213-02
凝血酶在临床医学领域当中具有一定的地位，其可以作用在血液当中的纤维蛋白原，促使其转变成为纤维蛋白，加速血液凝固，进而起到止血的作用。在临床当中主要应用于外伤、口腔、妇产科、消化道以及泌尿的止血[1]。本文筆者通过利用溶血素以及卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔到，通过溶血素孔径的特性来控制单链DNA以及双链DNA通过孔径的时候不同电流下降，对凝血酶与是凝血酶试题的亲和作用给予分析研究，现报告如下。
1资料与方法
1.1试剂与仪器
1.1.1主要试剂
其中包括有SA（溶血素）、APLI（卵磷脂）、盐酸、NEase（限制性核酸内切酶）、Tris、正葵烷以及KCl。试验当中所使用的水全部为二次去离子水，实验所使用的试剂全部为分析纯。试验当中使用到的DNA片段全部参考相关文献进行设计。
1.1.2主要仪器
仪器：Axonpatch200B，DigiData1440A，离心机，冰箱BCD-162AG，202-1AB型电热恒温干燥箱，BS124S电子天平、KQ-600DB型数控超声波清洗器、SZ-93自动双重纯水蒸馏器、CJJ78-1型磁力加热搅拌器、磁力架、数值式水浴温度控制仪、可调式移液器、PHS-3DpH计以及气浴恒温振荡器。
1.2试验方法
1.2.1DNA储备液和缓冲溶液
（1）全部DNA储备液都要采取二次水稀释为10-4M；（2）缓冲溶液Tris-HCl（10mM，pH7.8，1.0MKCl）：①：称取0.1213g Tris和7.455gKCI加入到80毫升烧杯当中加水溶解，采取稀释HCI调节pH一直到7.8；②：将以上溶液移到100毫升容量瓶当中加入水稀释一直到刻度线，即得0.01M Tris-HCl缓冲溶液。
1.2.2试验样品制备
（1）采取10 L10-4MSl注入样品管当中，采取Tris-HCl缓冲溶液稀释到10-6M，这个样品为G1；（2）采取10 L10-4MSl与10 L10-4MS2放在同一个样品管当中在37摄氏度之下孕育2小时，之后采取Tris-HCl缓冲溶液稀释到10-6M，这个样品为G2；（3）采取10 L10-4MSl与10 L10-4MS2放在同一个样品管当中在37摄氏度之下孕育2小时，之后向当中加入10 L5.0×10-4M的凝血酶在37摄氏度之下反应40分钟，之后计入970 L Tris-HCl缓冲溶液，这个样品为G3。
1.2.3卵磷脂处理
配制30mg·mL-1卵磷脂溶液：向盛有200毫克卵磷脂的瓶当中加入2毫升正葵烷，得到100mgmL-1卵磷脂溶液，选取60 l100mg·mL-1卵磷脂溶液，加入正葵烷稀释一直到200 l，即会得到30mg·mL-1卵磷脂溶液[2]。
1.2.4制备磷脂双分子层膜
（1）调整好相关仪器，采取1000 L的移液枪在检测槽的cis和trans端分别注入1毫升的Tris-HCl缓冲溶液，这个时候设置电压100mV开启检测，电流应该为无穷大显示过溢状态；（2）使用一个洁净的毛笔沾取一定量的30mg·mL-1卵磷脂涂抹在内部凹面上的小孔表面；（3）在电压100mV下运行工作软件，这个时候孔道处于封闭状态电流应该为0，这个时候打开膜电容界面观察膜电容的变化，当其上升和稳定的时候，即为磷脂双分子层膜成膜成功，这个时候可以停止运行软件，并且切换到电流-时间界面。如果这个环节下封闭状态电流没有为0或膜电容持续不稳定，则一定要把检测槽清洗干净重新开始[3]。
1.2.5在磷脂双分子层膜上形成纳米孔道
采取移液枪选取溶血素10 L 注入到cis端孔的表面，静止30分钟以后，打开工作软件，这个时候还必须要处于封闭电流状态，得到纳米孔道成形以后电流基线会出现一个短暂的突跃，这个时候即为成功形成纳米孔道，如果在这个过程当中电流基线在持续上线波动，则需要再一次制备磷脂双分子层膜。
2结果
因为颈环结构属于双链结构无法穿过溶血素纳米孔道卡在溶血素孔道当中，造成电流信号终止。另外，在高电压下颈环结构被破坏，颈环结构的DNA伸展为ssDNA。颈环结构卡在溶血素孔道当中，在高电压下颈环结构伸展，电流信号得以恢复。由于在140mV下颈环结构的伸展速度和DNA穿过溶血素纳米孔道的时候速度要比在120mV下速度快。G2结构是3`为适体S2与S1的杂交部分，5`端为颈环结构，这个时候的G2不管是3`端还是5`端在80mv电压之下全部无法顺利通过溶血素纳米通道，所以整个过程没有电流下降表现。
3讨论
DNA穿孔纳米孔道的时候，电流脉冲大部分集中在60pA左右。根据相关报道表明[4]，在低电压下颈环结构无法顺利通过溶血素纳米孔道，然而在高电压下颈环结构被伸展开，可以顺利通过纳米孔道。本文结果显示，G3在G2的基础之上加入凝血酶的结果，加入凝血酶以后，凝血酶适体S2被脱离出来，这个时候的G3样品通过纳米孔道的时候样品就是颈环结构的S1。另外，结果显示，在比较高的电压之下通过的碱基数要比低电压要多，并且比较高电压下颈环结构的伸展时间要比低电压的时间短。
总之，颈环结构可以在高电压下被伸展开，可以顺利通过纳米通道。颈环结构DNA解链时间和双链序列没有关系，和施加电压有密切关系。凝血酶作用以后的dsDNA可以顺利通过溶血素纳米孔道能够看见凝血酶，与凝血酶适体有非常高的亲和力，可以将凝血酶适体从dsDNA当中脱离开。
参考文献：
[1]丁克儉，张海燕，胡红刚，等.生物大分子纳米孔分析技术研究进展[J].分析化学，2010，38（2）：46.
[2]毓娟，揭雪飞，董新法，等.Ce02在催化氧化反应中的应用[J].电源技术，2012，26（1）：43-46.
[3]张梅，魏志锋，杜雪岩，等.CeO2包覆盖对TiO2传感器材料的氧敏性能的影响[J].稀有金属，2011，25（1）：71-74.
漆酶来源及绿色化学应用探析 第4篇
1.1 植物漆酶
生物界中漆酶的存在十分广泛, 除了漆树科植物外, 漆酶在拟南芥、水稻、松树、黄漆酶、棉花等物种中也存在, 可以确定的是, 在高等植物中漆酶的存在十分普遍。在拟南芥基因组中, 分别有3条染色体分布了17个漆酶基因, 其中2号染色体上5个, 3号染色体上2个, 5号梁色体上10个;而水稻基因中同样包含漆酶基因, 目前为止共发现6个漆酶基因片断, 26条表达序列标签。所以无论是单子叶或者双子叶植物, 都有可能存在复杂的漆酶基因家族。此外, 漆酶同工酶也是漆酶研究领域的一个重要内容, 其促进了漆酶研究的深入发展。研究同工酶可以发现新类型的酶, 比如白漆酶以及黄漆酶, 并且研究同工酶还可以对比、考察漆酶底物专一性, 进而实现对整个系统发育树的研究。植物来源不同, 即使是同种植物之间的漆酶序列同源性均会存在较大差异, 其所体现的是系统发育植物树的分散性。涉及到漆酶同工酶的研究比较多, 特别是真菌漆酶, 几乎每种产漆酶的真菌中均会包含几种同工酶。同工酶要以存在于同一个细胞、同一个组织或者同一个体不同组织或者同一种属之中。区别各种同工酶的差异主要对其糖链部分加以区分。
1.2 微生物漆酶
微生物漆酶可以分为两大类, 即真菌漆酶与细菌漆酶, 特别是对真菌漆酶的研究更加广泛, 迄今为止已经报道过的产漆酶真菌至少超过一千种, 这类研究成为该领域的热门话题, 其对漆树漆酶的研究有着重要的借鉴作用。相比之下细菌漆酶来源的研究就相对较少, 但是有专家推断, 细菌中漆酶的存在同样普遍, 只是需要人们更深入的研究、发掘。
1.3 动物漆酶
相对而言, 目前动物体中发现的漆酶还比较少, 已有的报道涉及到的相关动物体包括烟草天蛾、绿头苍蝇、麻蝇、猪肾以及蚊子与双翅目迁移类蝗虫等。尽管在这些动物体中漆酶的来源有相关报道, 但是仍要抱着小心对待的态度, 因为此类漆酶有可能是多酚氧化学酶, 其具有类似催化性能的特质, 有可能不是漆酶。
2 酶的稳定技术与固定化
所谓酶的稳定性是指在实际操作使用过程中, 储存环境、应用环境以及使用频率等因素不会酶的催化能力产生影响, 不过现阶段酶的稳定技术还属于生物技术研究领域中的关键问题。酶也属于生物物质的一种, 要保证其不受任何外界条件的影响而保持绝对的稳定性也是不现实的, 但是可以通过合理的技术将其损失降至最低。可以借鉴、参考其它的比较有效的手段对漆树漆酶的催化能力做进一步的改善与提高, 比如酶表面活性剂改性, 或者蛋白质工程技术, 或者诸如交联、共价吸附以及表面修饰等化学改性, 以及添加外源物质等技术手段, 均可以有效改善酶的稳定性。
随着科技的发展, 酶固定化的研究越来越深入, 应用也越来越广泛。酶的固定化其主要作用是对酶进行改性, 其实质也是属于酶与蛋白稳定化技术的一种。对于酶固定化研究体现出对环境敏感的特点, 再加之其自身的问题以及固定化漆酶应用的广泛性, 把漆酶固定在电极上是一种非常适用的方法, 特别是在微量的无溶剂检测方面, 适用性更强、更广泛。因为酶大部分都具有明显的水溶性, 不溶于或者很难溶于有机溶剂, 因此最常用的改性方法就是对酶做化学物理改性, 固定化技术的实质也属于一种常规性的改性方法。具体而言, 将葡萄糖脱氢酶与漆酶固定在一个Clark氧电极, 构造出一种酶传感器, 这种设备可以在一分种之内将就可待因与吗啡同步区分开来, 并可以实现对肾上腺素之类物质的检测;在可再生利用的铜螯合载体上固定漆酶, 可以把酒类生产过程中产生的酚去除;如果在尼龙海绵体上固定漆酶, 则可以将聚合染料聚R-478进行脱色, 程度可以达到90%。这种非离子表面活性剂具备较好的亲水性与亲油基团, 并且操作十分简单, 不会对酶活造成太大的影响, 得率高, 所以受到诸多关注。这种非离子表面活性剂最早经过报道后, 作者曾对其进行改进, 第一次采用绿色的方法合成得率至少96%以上的DHAD。不过这些方法通常会失去酶活, 最近几年发展出一种非离子型表面活性剂双十二烷基N-D-葡糖酸-L-谷氨酸酯改性酶的方法, 受到诸多学者的青睐, 其涉及到对蛋白质分子表面的改性或修饰。
3 漆酶在绿色化学中的应用
漆酶的应用十分广泛, 虽然在应用过程中为了促进其反应过程, 会加入一些中介物质, 但是针对漆酶的各种应用而言, 归根结底就是利用其催化氧化性能。漆酶的具体应用涉及到以下几个方面:
3.1 生物整治
目前为止主要是真菌类本科应用于生物整治或者生物修复领域, 特别是白腐真菌, 其产漆酶的水平很高。作用于烯烃时, 用白腐真菌产的漆酶将烯烃氧化, 实际分两个步骤:第一步, 酶先催化氧化一级底物, 然后将反应中的中介物添加其中;第二步, 中介物经过氧化后再对二级底物烯烃进行氧化, 受到氧化作用的烯烃会成为醛或酮。在选择中介物时, 效果最好的要属羟基苯并三唑, 脂肪多聚不饱和的和芳香烯丙基醇在20℃条件下只需两个小时即可处理完成, 全部氧化;在45℃条件下则需要二十小时, 脂肪烯丙基乙醇的氧化率可达70%。对其它诸如烯丙基乙醚烯烃、cis-2-庚烯以及环辛烯等烯烃, 其对氧化率的催化效果也十分明显。在生物整治领域, 漆酶还可以用来处理废水, 很多种工业染料都可以利用酶来脱色, 或者降解自然界的木块等等。漆酶在栎树叶之类的落叶中存在非常稳定, 可能是因为落叶中吸收了大量的腐殖酸, 据此可以大胆推测, 漆酶具备一项重要的生态功能, 即降解树叶。
3.2 作用于木质素
漆酶木质化的过程中体现出非常多的功能, 不仅包括木质素的生物合成, 也涉及到木质素的生物降解, 即植物漆酶合成木质素, 而真菌漆要则对木质素有降解作用。有学者以为漆树漆酶无法催化愈创木酚以及松析醇, 其与木质素的生物合成似乎没太大关系, 但其实不完全是, 如大槭树、连翘、针叶树等植物, 其所产的漆酶与木质素的合成有着密切的关系, 对松柏醇是有起到催化作用的, 只不过是速度相对要缓慢而已。虽然漆酶对于木质素的生物降解没有绝对的必要性, 但是漆酶可以把木质素的酚单元氧化为苯氧基。芥子醇受到漆酶的作用后, 会出现脱氢聚合反应。特别时有ABTS调节, 漆酶在对愈创木酚和β-O-4-二聚醇进行催化作用时, 会得到相对分子质量更大的产物。
从目前的研究报道来看, 漆酶的应用的确十分广泛, 并且还有许多功能和应用有待发现与发展, 近几年漆酶也被用于多环芳烃、石油烃污染物的生物处理, 因此加强对漆酶的研究有着重要的现实意义。
参考文献
[1]万云洋, 杜予民.漆酶结构与催化机理[J].化学通报, 2007, (9) .[1]万云洋, 杜予民.漆酶结构与催化机理[J].化学通报, 2007, (9) .
[2]杜予民, 孔振武, 李海萍.生漆多糖的分离与结构研究[J].高分子学报, 2009 (3) :[2]杜予民, 孔振武, 李海萍.生漆多糖的分离与结构研究[J].高分子学报, 2009 (3) :
[3]成凤桂, 陈玉.等电聚焦电泳法分离鉴定生漆中同工酶[J].中南民族学院学报:自然科学版, 2006 (1) .[3]成凤桂, 陈玉.等电聚焦电泳法分离鉴定生漆中同工酶[J].中南民族学院学报:自然科学版, 2006 (1) .
[4]宋宝东, 吴金川, 邢爱华, 等.表面活性剂包衣酶用于催化有机溶剂中的反应[J].化学工程, 2009 (2) .[4]宋宝东, 吴金川, 邢爱华, 等.表面活性剂包衣酶用于催化有机溶剂中的反应[J].化学工程, 2009 (2) .
酶化学法 第5篇
教学设计是根据教学对象和教学目标,解决教什么、怎样教的问题,以教学效果最优化为最终目的。团队成员选择 《生物化学》课程中的一个重点和难点问题 - 酶动力学研究制作相关专题微课 ( 专题1: 米氏方程; 专题2: 温度、p H对酶动力学的影响; 专题3: 抑制剂对酶动力学影响; 专题4: 酶活力概念及酶活力测定,各自制作一个8 ~ 10分钟左右的微课教学, 建立相关专题微课,通过教学实施并改进,力争达到预期目标[4]。
1教学设计准备
1.1教学目标
( 1) 使学习者准确理解和掌握酶抑制剂的概念和分类,不同抑制剂会导致动力学参数怎样的改变,原因是什么。
( 2) 使学习者提高学习知识的技能,例如在分析三种可逆抑制剂对动力学参数的影响时怎样用自己的语言来描述。
( 3) 使学习者掌握研究问题、分析问题、解决问题的方法,微课中讲到的磺胺类药物的作用机理就是实际运行理论来分析问题的典型案例。
( 4) 为后续酶工程的学习奠定基础。
1.2学情分析
《生物化学》课程作为化学工程与工艺、轻化工程专业课程在目前具有重要的意义,通过该课程的学习,使学生对本专业发展及应用有较大的帮助。根据培养计划,在教学过程中针对具体专业培养目标、课程矩阵情况确立教学目标,重点选择相应内容进行讲解,为其所用,因此具有很强的针对性; 教师具有近13年的生物化学一线教学经验; 学生 ( 考虑其知识储备,学习方式、思维方法、学习态度等) ; 教材选用高等教育 “十一五”国家级规划教材 《生物化学简明教程》 ( 第4版) 张丽萍,杨建雄主编 ( 高教出版社,2009) ( 见图2) 。
2教学设计实施
2.1重点与难点
( 1) 重点: 认真分析概念、分类等途径使学生理解和掌握抑制剂与变性剂等概念的区别,动力学参数变化。
( 2) 难点: 怎样从根据米氏方程中参数Vmax及Km的物理意义进一步分析其变化本质。
2.2设计理论依据
根据图3布鲁姆教育理论,整个微课制作过程中设计了6个环节,分别对应 ( 知识、理解,适用、分析、归纳小结、评价等维度水平,具体见下表的组织形式。
在制作过程中,制作者尽可能按照这种教育理论模式建立自身教学过程,在后期分别制作的8 ~ 10分钟视频中完全得到体现。
2.3教学方式与方法[4]
2.4教学过程安排
以专题3为例,设计教学过程安如表2。
2.5作业与考核
( 1) 课后要求学生通过相关移动终端观看视频,甚至自己制作视频。
( 2) 通过各种渠道进行交流探讨。
( 3) 考核方式应该多种多样,尤其在现代技术极其发展的情况下,对90后学生的学习特点,我们应积极引导而不是堵, 这样既能提高学生学习兴趣,又符合发展潮流。当然这对教师的要求较高,教育技术的飞快发展也将使得教师必须提高自己。
3教学设计反思
3.1设计说明
( 1) 通过前期参加学术会议和我们关于微课的经常讨论, 形成我们自己的一些看法,并将这些看法融入到我们的教学行为中,成为教学设计、制作微课录像的指导思想。目前的众多微课中,单个微课占绝大多数。用于教学,作用是很有限的。 单个微课知识分布很散,并且有很多微课重复同一个知识点。 这些微课如果要用于教学,日常教学需要的通常没有微课,有了微课的也不好查找。
( 2) 怎样才能更好地解决在教学中应用微课的问题呢? 那就是有计划有组织地制作专题微课,并搭建微课应用平台。例如网络教学走红的 “可汗学院”,单独看个别的微课程,萨尔曼·可汗的微课不一定很出彩。可是,可汗学院的是系列课程 ( 专题微课) ,3500个系列微课程视频融会贯通,支持可持续性地个性化学习。可汗可以站在更高的角度去审视一个学科中每一个知识点所应该教授的程度,并配合以自己更深的理解,更深入浅出地讲述。值得注意的是,可汗的讲述往往已经超越了教材。微课带来了有关微课的教学改革。如 “颠倒课堂”,实现了学生的高效和个性化学习。无论是 “可汗学院”,还是 “颠倒课堂”,都是以系列专题微课为依托的。
( 3) 单个微课若不去反思学科中每一个知识点之间更深的关系,不去超越教材就难以突破微课价值的瓶颈。拿出一个微课和可汗的微课程一比,有可能反倒是赢了。但是不成体系的微课,不足以支持学生可持续的个性化学习,在教学中也难以应用。因此微课不能以数量取胜,不以单个完美而取胜。要让微课构建成一个个有机联系的整体,充分发挥其所长,服务于教学,服务于师生。
基于上述的感性认识,作为我们开发专题微课,并进行微课教学设计和录制的指导思想和教学改革的动力源泉。
3.2教学评价
( 1) 自我评价: 教学思想先进,符合时代要求; 课程内容安排合理,条理性强,符合认知规律; 信息量大; 教学内容理论联系实际,注重学生综合素质和能力培养。因材施教,方法灵活; 课程讲授能激发学生的学习兴趣,促进学生积极思维和调动学生潜在的能力,给学生以深刻的创新熏陶; 积极开展教学法研究与应用,科学、合理、有效使用现代教育技术,效果好; 注重引导学生自主学习。
( 2) 同行专家评价: 多次进行过公开课,专家评价良好。 ( 见公开课评价) 。
( 3) 学校评价: 团队近五年获得较多学校教学方面的荣誉。( 省现代教学技术优秀奖、校教学优秀奖、教坛新秀、教学十佳等) 。
( 4) 学生评价: 近五年学评教为A ( 见学校教务处评价系统) 。
3.3教学设计及实施不足
( 1) 语言不够严谨、精炼,缺乏活力,在录播时紧张,个人平时教学特色不能充分发挥;
( 2) 由于我们对录播设备及后期制作知识了解不多,所以对做出微课视频效果不满意,还需努力。
摘要：专题微课是基于一门课程的某个重要的专题(单元、主题等)而设计开发的一种微型在线视频网络课程。由于高校课程的特殊性,单一的微课不能解决一个比较复杂的知识点(因为微课时间必须要微),因此专题微课在高校方兴未艾。教学团队选择《生物化学》中的一个重要内容-酶动力学知识,按照专题微课的模式进行了教学设计,制作相关微课,并对实施后进行了反思,期与同行探讨。
酶化学法 第6篇
喹诺酮类抗菌药以细菌的脱氧核糖核酸 (DNA) 为靶位, 通过选择性地抑制细菌DNA促旋酶与拓扑异构酶Ⅳ, 造成染色体的不可逆损害, 从而使细菌不再分裂, 主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物对革兰阳性菌的作用较弱 (某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用) [5,6]。
喹诺酮类抗菌药按发明先后及其抗菌性能的不同, 分为1, 2, 3, 4代, 第1代喹诺酮类抗菌药的品种有萘啶酸和吡咯酸等, 第2代喹诺酮类抗菌药的品种有新恶酸和甲氧恶喹酸等, 第3代喹诺酮类抗菌药的品种有诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星和环丙沙星等, 第4代喹诺酮类抗菌药的品种有加替沙星与莫昔沙星等[4,7,8,9]。
喹诺酮类抗菌药可用于治疗呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、消化系统感染及其他感染, 还可用于抗肿瘤和抗病毒, 但该类药物对人体也存在很大的不良反应, 如胃肠道反应、中枢反应、可诱发癫痫、影响软骨发育、易产生结晶尿及导致肝损伤等[10,11,12]。
喹诺酮类药物残留分析通常包括:选用适当的溶剂提取, 进一步利用液液萃取法、固相萃取法等进行净化、浓缩, 最后用高效液相色谱法 (HPLC) 、高效毛细管电泳法 (CE) 、液相色谱质谱联用技术 (LC-MS) 等方法进行检测, 有时还使用气相色谱法 (GC) 、高效薄层色谱法 (HPTLC) 、微生物法 (MA) 、免疫分析法 (IA) 等测定[13,14,15]。
目前的检测方法主要是仪器分析法, 而ELISA法在稳定性和准确度方面存在着一定的局限性, 大部分只能检测一种或者几种药物[16], 对于种类较多的喹诺酮类药物还远远不能达到同时检测多残留的要求。化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定、快速、检测范围宽、操作简单、自动化程度高、试剂稳定且有效期长 (6～18个月) 等优点, 其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量级[17]。化学发光底物液是化学发光酶免疫检测方法的关键试剂, 配制出低成本、性能良好、适合国产仪器使用的发光底物液可降低化学发光方法的使用成本, 有利于在基层普及。建立稳定的化学发光酶免疫分析方法是进行化学发光试剂盒研制的基础, 同时对于严把食品安全的检验环节有重要的意义。
1 材料
1.1 仪器与设备
电子天平 (型号为2000SBL) , 美国Setra公司生产;磁力搅拌器 (型号为90-2) , 上海振荣科学仪器有限公司生产;微量移液器 (单道 20～200 μL、100～1 000 μL, 多道50～300 μL) , 美国Thermo公司生产;氮吹仪 (型号为DSY-Ⅲ) , 北京金科精华苑科技有限公司生产;漩涡混合器 (型号为QL-901) , 海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产;低速离心机 (型号为Anke TDL-40B) , 上海安亭科学仪器有限公司生产;微孔板式发光仪 (型号为CentroLB960) , 德国Berthold公司生产;Opti-plateTM化学发光板, Perkin Elmer公司生产;生化培养箱 (型号为DHP-600) , 天津市中环实验电炉有限公司生产。
1.2 药物与试剂
喹诺酮类药物标准品, 德国Dr.Ehrenstorfe公司生产;鲁米诺、牛血清白蛋白 (BSA) 、卵清蛋白 (OVA) , Sigma公司生产;乙酸乙酯、聚乙二醇4000 (PEG4000) 、冰醋酸、层析柱、N, N′-二环己基碳二亚胺 (DCC) 、二甲氨基吡啶 (DMAP) 、三乙胺、氨基丙酸叔丁酯, 国药集团化学试剂有限公司生产;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗, 美国Jackson公司生产;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂, 北京望尔生物技术有限公司生产;其他有关化学试剂均为分析纯。
2 试剂盒组成及其制备
2.1 试剂盒的组成
喹诺酮类药物化学发光试剂盒包括:96孔化学发光板1块 (包被有耦联抗原) ;标准液6瓶 (1 mL/瓶) , 浓度为0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1 ng/mL;高浓度标准品 (1 mL/瓶) , 浓度为1 μg/mL;酶标二抗7 mL;抗体工作液7 mL;鲁米诺化学发光液为A液6 mL、B液6 mL;20倍浓缩洗涤液40 mL;2倍浓缩复溶液50 mL。
2.2 抗原的合成
2.2.1 诺氟沙星衍生物的合成
将1 mmol诺氟沙星溶于15 mL三氯甲烷中, 加入N, N′-二环己基碳二亚胺2 mmol、二甲氨基吡啶催化量、氨基丙酸叔丁酯1.5 mmol, 室温搅拌5 h;用薄层色谱法 (TLC) 监测, 原料消失后过滤, 将液相水洗, 用无水Na2SO4干燥, 层析柱 (洗脱剂, 乙酸乙酯∶石油醚=1∶5) 纯化。将上述产物溶于冰醋酸中, 室温搅拌2 h;用TLC监测, 原料消失后减压脱溶剂;将得到的黏稠物溶于1 mol/L NaOH溶液中, 调节pH值为3～5;乙酸乙酯萃取, 无水Na2SO4干燥, 层析柱纯化 (洗脱剂, 乙酸乙酯∶石油醚=1∶1) , 得到喹诺酮类药物半抗原 (薄层色谱条件为CH2Cl2与甲醇 (MeOH) 的体积比为1∶1) 。
2.2.2 免疫原的合成
取15 mg诺氟沙星半抗原, 溶于1 mL 二甲基甲酰胺 (DMF) 中;取15 mg二氯乙烷 (EDC) , 用0.2 mL水充分溶解后于加入溶解有诺氟沙星半抗原的DMF中;室温下搅拌24 h, 即可得到反应液A。称取牛血清白蛋白40 mg, 使之充分溶解在3 mL PBS (pH 值为7.2) 中;将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中, 并于室温下搅拌24 h;用0.01 mol/L PBS于4 ℃透析3 d, 每天换透析液3次, 以除去未反应的小分子物质;分装, 于-20 ℃保存, 备用。
2.2.3 包被原的合成
称取诺氟沙星半抗原20 mg和OVA 30 mg, 按2.2.2的步骤操作, 包被抗原, 供包被用。
2.3 单克隆抗体的制备
取上述制备出的免疫原 (QNS-BSA) 以生理盐水溶解, 并与弗氏完全佐剂等体积混匀;按100 μg/只颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠 (北京勒邦生物技术有限公司自繁自养) , 将免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀, 于初次免疫后第7, 14, 28天各追加免疫1次;融合前3 d以免疫复合物100 μg/只且不加弗氏佐剂再追加免疫1次。按常规方法取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0) , 混合, 然后在45 s内缓慢加入预热的融合剂 (PEG4000) 进行融合;用HAT培养基悬浮均匀, 再加入适量的饲养细胞, 于37 ℃、5%CO2培养箱中用96孔培养板培养;5 d后用HT培养基半换液, 第9天进行全换液, 得到杂交瘤细胞;将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养, 收集上清液用间接ELISA法测定效价, 冻存。取8～10周龄Balb/c小鼠, 腹腔注射液体石蜡, 0.5 mL/只, 7～10 d后腹腔注射杂交瘤细胞, (1～2) ×106/只;7～10 d后抽取小鼠腹水, 离心取上清液, 测定效价, 冻存, 备用。
2.4 其他试剂的制备
2.4.1 喹诺酮类药物标准溶液的制备
以常规方法将喹诺酮类药物纯品用含有10%甲醇和pH值为 7.4的0.05 mmol/L PBS配制成浓度分别为0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1 ng/mL的喹诺酮类药物标准溶液。
2.4.2 酶标二抗工作浓度的制备
取辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗, 使用时用洗涤溶液配制成1∶2 000的工作浓度。
2.4.3 抗体工作液的制备
喹诺酮类药物抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体, 将所得喹诺酮类药物抗体用洗涤溶液稀释成1∶32 000的工作浓度。
2.4.4 鲁米诺化学发光溶液的制备
A液:0.01 mol/L鲁米诺、0.001 mol/L对甲苯酚、三 (羟甲基) 氨基甲烷溶液的pH值为8.8。B液:100 mL溶液中含柠檬酸2.1 g、无水Na2HPO4 2.82 g、0.75%的过氧化氢脲溶液0.64 mL。
2.4.5 浓缩复溶液
将NaH2PO4·2H2O 5.74 g、Na2HPO4·12H2O 32.6 g溶于1 L的去离子水中即得。
2.4.6 浓缩洗涤液
按体积分数0.05%将吐温-20添加至pH值为7.4、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中即得。
2.5 喹诺酮类药物化学发光检测方法的建立
2.5.1 酶标板的制备
用包被缓冲液将喹诺酮类包被原稀释成20 μg/mL, 每孔加入100 μL, 于37 ℃温育2 h, 倾去包被液;然后在每孔中加入150 μL封闭液, 于37 ℃温育2 h, 倾去孔内液体, 用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤1次, 拍干。
2.5.2 确定抗原、抗体的最佳稀释比例
采用方正滴定法确定包被抗原与单克隆抗体的最佳工作浓度。将包被原按40.0, 20.0, 10.0, 5.0, 2.5, 1.25 μg/mL的系列稀释度包被酶标板, 将酶标喹诺酮类单克隆抗体按1∶1 000, 1∶2 000, 1∶4 000, 1∶8 000, 1∶16 000, 1∶32 000, 1∶64 000, 1∶128 000的比例稀释, 用方正滴定法确定抗原、抗体的最佳稀释比例。
2.5.3 喹诺酮类药物化学发光酶联免疫方法标准抑制曲线的绘制
向用喹诺酮类耦联包被原包被的酶标板微孔中加入浓度分别为0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1 ng/mL的喹诺酮类标准品溶液各50 μL, 每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗50 μL;再加入喹诺酮类单克隆抗体工作液50 μL, 轻轻振荡混匀;用盖板膜封板, 于25 ℃恒温箱中反应15 min;倒出酶标板微孔中液体, 重复洗酶标板5次, 拍干;每孔加入化学发光显色液100 μL, 轻轻振荡混匀, 3 min后用微孔板式发光仪测定每孔的发光强度。每个浓度的标准品溶液的发光强度平均值 (RLU) 除以第1个标准品溶液 (0 标准) 的发光强度值 (RLU0) 再乘以100%, 得到百分发光强度值, 以喹诺酮类药物标准品浓度的对数值 (取以10为底的对数) 为横坐标, 百分发光强度值为纵坐标, 绘制标准曲线。
2.5.4 检测与其他药物的交叉反应率 (CR)
以环丙沙星为标准, 按照试剂盒程序操作, 加入不同喹诺酮类竞争物和非喹诺酮类竞争物, 以试验所得化学发光强度值计算抑制百分比并制作标准曲线, 根据线性方程计算各竞争物50%抑制浓度 (IC50) 。交叉反应率即为抗体对环丙沙星的IC50与抗体对竞争物的IC50之比的百分数, 计算公式:交叉反应率 (%) =抗体对环丙沙星的IC50/抗体对其他竞争物的IC50×100%。
2.5.5 鱼肉中喹诺酮类药物残留检测
取 (2.00±0.05) g均质鱼肉样本至50 mL聚苯乙烯离心管中, 加入0.1 mol/L盐酸溶液1 mL, 再加入5 mL乙腈, 立即用振荡3 min;于室温 (20～25 ℃) 、4 000 r/min离心5 min;取1 mL上清液于10 mL玻璃试管中, 于50～60 ℃水浴氮气流下吹干;加入1 mL正己烷, 用涡旋仪涡动30 s;再加入1 mL磷酸盐缓冲液涡动20 s;于室温 (20～25 ℃) 、4 000 r/min离心5 min, 除去上层有机相, 取下层50 μL用于分析。
2.5.6 最低检测限
取20份空白样品, 按照2.5.5步骤处理后所建立的ELISA 方法进行检测。通过标准曲线计算对应的浓度。以20 份空白样品对应的样品浓度平均值加上3 倍标准差作为样本检测的最低检测限, 最低检测限undefined。式中:undefined为20份空白样品的平均值, s为20份空白样品的标准差。
2.5.7 准确度及精密度的测定
取环丙沙星标准品分别对鱼肉样品按照0.3, 0.6 ng/g的剂量进行添加回收试验。分别抽取3个批次试剂盒进行检测, 每个浓度做6个重复, 每个样品设2个平行, 计算准确度及精密度。
2.5.8 试剂盒稳定性试验
取喹诺酮类药物化学发光试剂盒用于稳定性试验的测定, 分别置于-20 ℃冰箱和37 ℃温箱6 d后进行试验, 比较放置前后各标准品发光强度值变化。
3 结果
3.1 喹诺酮类药物半抗原TLC色谱 (见图1) 以及半抗原结构特点
从TLC色谱图中可以看出, 在450 nm紫外灯下喹诺酮类药物半抗原在薄层板上已经呈现出规则的原点状, 并且无拖尾现象, 证明合成的喹诺酮类药物半抗原的纯度较高。
3.2 包被抗原及喹诺酮类药物单克隆抗体的最佳稀释倍数
经方正滴定法试验, 根据试验得到的0标准品OD值和0.1 μg/L标准品OD值计算抑制率, 结果见表1。
对于酶标仪, OD值在1～2之间时读数的可信度较大, 所以一般取OD值在1.5～2.0之间的孔所对应的包被浓度为最佳包被浓度。另外, 从试剂盒的灵敏度和准确度考虑, 一般控制抑制率在70%～80%之间。由表1可知:抗体、抗原包被浓度过大, OD值普遍偏高, 另外抗体浓度大或包被浓度大也会造成不必要的浪费;抗体浓度小或者抗原包被浓度太小, 则造成整个板显色偏低。当抗原包被浓度为20 μg/mL, 喹诺酮类药物单克隆抗体稀释倍数为1∶32 000时, 试验效果较理想 (OD值在1.5～2.0之间, 抑制率在70%～80%之间) 。因此, 确定抗原包被浓度为20 μg/mL, 喹诺酮类药物单克隆抗体的稀释倍数为1∶32 000。
3.3 竞争反应时间优化
按上述试验方法加入标准品和标记抗体, 分别在10, 15, 20, 25 min后加入发光溶液, 测定0标准品的发光值。结果表明, 在反应15分钟时发光值最大, 因此本试剂盒选取反应时间为15 min, 结果见图2。
根据确定好的反应模式和反应时间, 与常规EILSA方法进行反应时间比较, 结果见表2。
由表2数据计算可知, 与常规ELISA试剂盒相比, 化学发光试剂盒节省至少节省27 min, 最多可节省72 min。
3.4 标准曲线
以喹诺酮类药物标准品浓度对数值为横坐标、百分发光强度值为纵坐标绘制抑制标准曲线, 结果见图3。
由图3可以看出, 得到的曲线线性方程为y=-29.933x+29.991, 线性相关系数R2=0.990 5。
为更直观地对样品中喹诺酮类药物进行分析, 将喹诺酮类药物浓度对数值用专业分析软件替换为环丙沙星浓度, 制作标准工作曲线, 用以分析样品中喹诺酮类药物残留, 所得标准工作曲线见图4。
由图4得出, IC50值为0.211 ng/mL, 线性范围为0.1～8.1 ng/mL。
3.5 喹诺酮类药物试剂盒的特异性
喹诺酮类药物单克隆抗体对其类似物及其他药物的交叉反应率见表3。
由表3可以看出, 该单克隆抗体对12种喹诺酮类药物的交叉反应率均较高, 而对非喹诺酮类药物基本无交叉反应, 所以该试剂盒可以同时检测12种喹诺酮类药物的总残留量。
3.6 最低检测限的测定结果 (见表4) 对20份空白鱼肉样本进行检测, 测定结果的平
注:平均值为0.09, 标准差为0.05, 最低检测限为0.25。
均值加上3 倍标准差为该方法对实际样本的最低检测限, 结果平均值为0.09 ng/g, 标准差为0.05 ng/g, 利用公式计算, 该试剂盒对鱼肉样本的最低检测限为0.24 ng/g。
3.7 准确度与精密度的测定结果
ELSIA 法的准确度以回收率表示, 精密度以变异系数来表示。取鱼肉样本分别添加环丙沙星标准品至0.3, 0.6 ng/g, 对样本进行添加回收试验, 分别计算准确度和精密度, 检测结果见表5。
由表5可知, 试剂盒对鱼肉样本的添加回收率在70.0%～100%之间, 批内变异系数在6.1%～14.0%之间, 批间变异系数在9.9%～10.9%之间。
3.8 试剂盒稳定性的测定结果
试剂盒分别放置于-20 ℃冰箱和37 ℃温箱6 d后进行试验, 比较放置前与放置后参考标准品各点RLU值, 参考标准品各点RLU值未见明显降低, 且本底发光值无明显升高, 表明试剂盒标准曲线无明显漂移, 满足稳定性要求。在实际应用中, 试剂盒一般存放在2～8 ℃冰箱, 因此对于整体试剂盒的稳定性评判还需要进行2～8 ℃放置保存试验, 从而进一步验证试剂盒的稳定性。
4 结论
由于喹诺酮类药物是小分子物质, 没有免疫原性, 所以必须连接到大分子载体上产生特异性免疫应答[18,19,20,21], 本试验将喹诺酮类药物诺氟沙星的衍生物分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白耦合成免疫原和包被原。本研究根据间接竞争反应原理建立快速检测喹诺酮类药物的一步式化学发光酶联免疫检测方法 (CLEIA) , 经进一步优化, 其最佳反应条件:抗原包被浓度为20 μg/mL, 包被温度为37 ℃, 反应时间为2 h, 喹诺酮类药物单克隆抗体最佳稀释倍数为1∶32 000, 竞争反应时间为15 min, 洗涤液pH值为7.4、含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。本研究所制备的单克隆抗体对喹诺酮类药物具有很高的灵敏度, 并且对喹诺酮类药物抑制标准曲线线性良好, 对12种喹诺酮类药物类似物的交叉反应率较高, 而对其他非喹诺酮类药物基本无交叉反应。该试剂盒的线性范围为0～8.1 ng/mL, IC50为0.211 ng/mL, 对鱼肉的最低检测限为0.24 ng/g, 样本添加回收率在70.0%～100%之间, 批内变异系数在6.1%～14.0%之间, 批间变异系数在9.9%～10.9%之间。
酶化学法 第7篇
一直以来,纳米粒子的模拟酶催化活性不为人所发现。 2007年,阎锡蕴小组最先发现Fe3O4磁性纳米粒子(Fe3O4MNPs)具有类似辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)的催化活 性[4]。在过氧化 氢存在的 条件下,Fe3O4MNPs能有效催化氧化不 同类型的HRP底物发生 显色反应,产生与HRP催化完全相同的颜色(如图1所示),Fe3O4MNPs催化氧化 天然酶底 物3,3′,5,5′-四甲基联 苯胺 (TMB)发生显色反应,产生蓝色,当加入H2SO4时颜色终 止;并且Fe3O4MNPs的催化活性与pH值、温度和过氧化氢浓度有关,催化机理与辣根过氧化物酶(HRP)相似,催化动力学符合典型的米氏动力学。结果还表明Fe3O4MNPs对显色底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、2,2′-联氮双(3乙基苯并噻啤啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)的亲和力要比HRP强,能够承受高浓度过氧化氢而不失去活性。据此,研究者提出Fe3O4MNPs是一类过氧化物模拟酶。
自从基于Fe3O4MNPs的过氧化物模拟酶性质被发现后,纳米粒子作为模拟酶的研究迅速崛起,备受关注。人们相继开展了磁性纳米粒子、金属纳米粒子、碳纳米材料等纳米微粒模拟酶性质的相关研究工作。基于不同的纳米材料, 能够模拟不同酶催化活性的纳米模拟酶不断被发现[5]。
纳米模拟酶的发现改变了以往无机纳米材料是一种生物惰性物质的传统观念,大大拓展了纳米材料的应用范围。 与天然酶或者传统的模拟酶相比,纳米模拟酶既是酶,又是纳米材料。因此它们除了具有类似酶的催化性能外,还有纳米材料本身的物理和化学特性,如有着大的比表面积,更有利于进行化学修饰。近几年,国内外的研究人员制备出各种各样的新型纳米材料模拟过氧化物酶并用于生物传感器的制备。本文主要总结近年来关于纳米材料作为过氧化物模拟酶在比色分析及电化学传感器中的研究应用及进展。
1 磁性纳米粒子
1.1 磁性氧化铁纳米颗粒
近年来磁性纳米颗粒因其特有的机械电磁光以及化学特性在纳米医学与纳米生物技术中得到广泛应用。一般而言,在磁分离和检测技术的应用中,磁性纳米粒子都被认为是生物学和化学惰性的,但是有报道表明Fe3O4MNPs具有内在的类似于HRP的过氧化 物酶活性[6,7,8,9]。磁性Fe3O4MNPs有很多特点:(1)其具有尺寸效应,催化活性随着材料粒径的减小而 增强,颗粒的粒 径越小,其催化活 性越高。 (2)其催化活性依赖于反应环境的温度、pH值和底物浓度, 与辣根过氧化物酶类似。(3)其稳定性好。另外,它的制备方法简单、成本低、易于大规模制备,同时还兼具磁性等其他多功能特性[10]。
大多数常规电化学传感器测定过氧化氢或葡萄糖需要天然酶HRP或葡萄糖氧化酶的参与。然而,天然酶固有的缺点如失活、泄漏、昂贵等限制了它们的实际应用。具有过氧化物模拟酶性质的纳米粒子的发现,为电化学传感器的构建提供了新的方法。董绍俊小组首次使用Fe3O4MNPs构建简单高效的无酶电化学传感器用于检测过氧化氢[11],采用该方法所制备的传感器具有较高的灵敏度和较好的稳定性。 Park等则把Fe3O4MNPs和葡萄糖氧化酶(GOx)包覆在介孔碳的孔道中构建高效电化学传感器[12]。杨秀荣课题组将壳聚糖修饰的Fe3O4MNPs共价功能化在电极表面[13]。该电极对过氧化氢响应快速,检出限达10μmol/L,线性范围为0.2~2mmol/L。该课题组基于Fe3O4MNPs和胆碱氧化酶修饰金电极,研制了一种灵敏的检测胆碱的传感器[14]。该胆碱传感器对胆碱检测具有较宽的线性范围(10-9~10-2mol/ L)和较低的检测限(0.1nmol/L)。电极制备过程如图2所示[14].
Fe3O4MNPs也被广泛应用到比色检测中。比色检测是最简单、快速、可视化检 测的方法,其原理是 基于Fe3O4MNPs催化过氧化物的一系列有机底 物显色。利用Fe3O4MNPs的过氧化物模拟酶和磁性分离的双重性质,阎锡蕴课题组建立了两种酶联免疫方法(ELISA)来检测抗原[4]。检测原理如图3所示。
第一种方法与常规ELISA一样,仅用Fe3O4MNPs代替HRP与蛋白质A结合。第二种方法更为有效,Fe3O4MNPs扮演捕获、分离和检测的多重功能。
Wang等利用共沉淀法制备了Fe3O4MNPs,建立了利用Fe3O4MNPs的过氧化物模拟酶的催化活性检测过氧化氢和葡萄糖的可视化方法,比色测定葡萄糖时选择性较高,麦芽糖、乳糖和果糖均不干扰葡萄糖[6]。阎锡蕴课题组还建立了集磁性纳米颗粒催化活性及磁性分离特性于一体的免疫检测方法,利用Fe3O4MNPs类酶活性,能够方便地测定到酸雨中过氧化氢含量,检测灵敏度可以达到1.75×10-7mol/ L,检测线性范围为0~70μmol/L[15]。Tang等建立了利用Fe3O4MNPs作为过氧化物模拟酶催化底物N,N-二乙基-p苯二胺硫酸盐(DPD)检测过氧化氢的方法,该方法已成功应用于雨水、蜂蜜和牛奶样品中H2O2的检测[7]。Su等制备了ZnFe2O4磁性纳米颗粒 (ZnFe2O4MNPs),并首次发 现ZnFe2O4磁性纳米颗粒具有过氧化物模拟酶的催化活性。他们利用ZnFe2O4磁性纳米颗粒的过氧化物模拟酶的催化活性, 建立了一种可视化检测过氧化氢和葡萄糖的新方法。该方法已成功用于糖尿病患者尿液中葡萄糖的测定[16]。
1.2 磁性复合纳米材料
磁性复合纳米材料可以发挥磁性纳米粒子与其他材料的协同作用,为电化学传感器的发展提供了新的思路。目前常见的磁性纳米复合材料有:磁性二氧化硅复合颗粒[17,18], 双功能和多功能磁性复合颗粒等[19]。最近几年,人们采用多种方法制备了Fe3O4@Au和Fe3O4@Pt磁性复合 纳米粒子[20,21],常见的纳米复合材料还有:Fe3O4-氧化石墨烯复合纳米材料[22],二茂铁功 能化的Fe3O4@SiO2磁性纳米 粒子[23],核壳金属或金属氧化物包裹的Fe3O4磁性纳米粒子。
彭花萍小组 采用简单 的一步原 位合成方 法制备了Fe3O4/还原石墨烯(Fe3O4/rGO)复合物,在无需生物酶及其他电子介体存在的情况下,Fe3O4/rGO复合材料对H2O2的电化学还原具有高效协同催化作用[24]。谢建新小组研制了四氧化三铁-多壁碳纳米管(MWCNTs)复合纳米材料双过氧化物模拟酶传感器测定过氧化氢和葡萄糖,通过带负电荷的羧基化MWCNTs和带正电荷的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)-Fe3O4磁性纳米粒子之间强的静电作用制备了Fe3O4-MWCNTs复合纳米材料。由于Fe3O4磁性纳米粒子和MWCNTs具有协同催化效应,复合纳米材料的催化活性比单一的纳米粒子的催化活性要强[25]。Luo等制备了一系列的CoxNi1-xFe2O4(x =0,0.2,0.4,0.5,0.6,0.8, 1.0)复合磁性纳米材料,利用它的过氧化物模拟酶活性催化H2O2。结果发现CoxNi1-xFe2O4的催化效果最好,把它用于牙膏中过氧化氢的检测,检测范围为1.0×10-8~1.0×10-3mol/L,检测下限达到3.0×10-9mol/L[26]。Wu等制备了哑铃形状的Pt-Fe3O4纳米材料,用它标记鳞状细胞癌抗体,利用Pt-Fe3O4纳米材料的过氧化物模拟酶活性,催化H2O2,制备了一种超灵敏的电化学免疫传感器来检测鳞状细胞癌[27]。 其制备过程如图4所示。
2 贵金属纳米粒子和纳米合金
2.1 贵金属纳米粒子
随着科技的发展,纳米材料已经成为当今科学研究的重点,其中银、金、铂、钯等贵金属纳米材料由于具有优越的催化性能,在过氧化氢传感器方面得到了广泛的研究和应用。
研究发现金属纳米粒子或纳米簇具有模拟酶催化活性, 可应用于生化分析领域。李保新课题组报道了带正电荷的巯基乙胺修饰的带正电荷的Au NPs具有过氧化物模拟酶催化活性。他们比较了柠檬酸修饰的带负电荷的AuNPs与巯基乙胺修饰的带正电荷的Au NPs的过氧化物模拟酶的催化活性。结果表明,由于Au NPs表面所带电荷不同,导致其吸附过氧化氢和传递电子的能力的差异,使巯基乙胺修饰的带正电荷的Au NPs的催化性大于柠檬酸修饰的带负电荷的Au NPs。他们还利用其过氧化物模拟酶催化活性测定了过氧化氢和葡萄糖[28]。
杨云慧课题组研制了一种基于纳米金标记的适体传感器,该传感器在可卡因浓度为1×10-6~1.5×10-4mol/L的范围内有良好的线性关系,检测下限 为4.0×10-7mol/L。 他们利用金标DNA(可卡因互补DNA)催化氧化H2O2,采用计时电流的方法间接测定可卡因,如图5所示[29]。
Wang等发现牛血清白蛋白(BSA)稳定的Au团簇表现出高度的内在过氧化物模拟酶活性。由于BSA-Au团簇体积超小,稳定性好,在水溶液中的生物相容性比其他种类的纳米粒子更高,因此更适 合用于生 物分析。该课题组 利用BSA-Au团簇的过氧化物模拟酶活性制备比色传感器用来检测黄嘌呤[30]。
除了金纳米材料以外,人们还发现银纳米材料也具有过氧化物模拟酶的催化活性。Huang等利用壳聚糖修饰的Ag NPs检测了过氧化氢和葡萄糖[31]。E.Kurowska等制备了银纳米线阵列,利用其对过氧化氢的催化性,制备了敏感和快速的过氧化氢传感器[32]。Yang等利用所制备的肌酸酐修饰的Cu纳米颗粒 的过氧化 物模拟酶 的催化活 性检测了DNA[33]。
2.2 纳米合金
近年来,复合纳米颗粒的研究引起了人们的兴趣,与单一组分相比,复合纳米颗粒表现出多 样的功能 和独特的 特性。由于金属纳米粒子之间的相互协同作用,使得它们的催化活性明显优于单一金属纳米粒子。双金属纳米合金粒子可以通过第二种金属的加入对复合组分的物理和化学性质加以调节,它们被广泛地应用于催化、光电子学、信息存储、 生物标记等众多领域。
吴晓春课题组制备了不同形貌和结 构的Ag/M (M= Au,Pd,Pt)合金纳米 粒子,并发现这 些纳米粒 子具有类 似HRP性质的过氧化物模拟酶催化活性,以Ag/Pd合金纳米粒子为例,研究了它的催化活性与组成、尺寸和形貌之间的关系[34]。该研究小组发现外壳修饰Pt纳米点的Au纳米棒具有氧化模拟酶、过氧化物模拟酶和过氧化氢模拟酶催化活性[35]。李文韬采用电沉积的方法,将Au/Pt合金纳米粒子修饰到玻碳电极(GCE)上制备了一种无酶的过氧化氢化学传感器,并将其用于H2O2的电催化氧化性能的研究。在优化条件下,此传感器在较宽的浓度范围内(1.0×10-7~ 4× 10-2mol/L),对H2O2有较好的电化学响应,且检测极限接近纳摩尔每升,灵敏度较高[36]。Niu等制备了雪花状的Pt/ Pd双金属合金,用作丝网印刷金电极的基底制备过氧化氢传感器。研究表明Pt/Pd双金属合金对过氧化氢的催化能力远远高于单独的Pt和Pd[37]。Janyasupab等合成了Pt/M (M = Cu,Ni,Pd,Rh)双金属并用于过氧化氢传感器的制备,比较了Pt/Rh、Pt/Pd、Pt/Cu和Pt/Ni对过氧化氢催化的灵敏度和选择性[38]。最近,Chang等发现Pt/Ir复合纳米材料也具有过氧化物模拟酶活性[39]。
3 碳纳米材料
碳纳米材料是目前纳米材料领域最受关注的研究热点, 已合成出针状、棒状、桶状等各种各样的碳纳米材料。其中碳纳米纤维、碳纳米管等新型碳材料具有许多优异的物理和化学特性,被广泛地应用于许多领域。
常见的碳纳米材料有碳纳米管、石墨烯、氧化石墨烯和碳纳米点。碳纳米管(CNTs)是一种长径比相当大,粒径在纳米尺度的管状材料[40]。石墨烯作为一种新型材料,厚度仅为单个原子厚度,具有sp2杂化平面结构,近年来成为研究热点[41]。
Qu等发现单壁碳纳米管(SWNTs)的过氧化物模拟酶的催化活性。该课题组又通过点击化学制备了多壁碳纳米管(MWCNTs)与Fe3O4@Si的复合材料,并利用其过氧化物模拟酶催化活性实现Cu2+可视化检测[42]。2004年,曲晓刚课题组制备了多色碳纳米粒子,并发现其具有内在的过氧化物模拟酶催化活性[43]。Qu等还发现氧化石墨烯在过氧化氢存在下,表现出类过氧化物酶活性[44]。Zhu等通过水热-氢气还原法制备了螺旋状碳纳米管,并同时考察了它的过氧化物模拟酶催化活性,研制了测定过氧化 氢电化学 生物传感 器,其线性范围为0.5~115μmol/L[45]。杨云慧课题组研制了基于氧化石墨烯和铂纳米颗粒复合材料过氧化氢无酶传感器。他们按照Hummers方法制备出氧化石墨然后在水中进行超声剥离出氧化石墨烯,利用氧化石墨烯和铂纳米颗粒对过氧化氢的协同催化作用将该修饰电极用于过氧化氢的测定[46]。Yang等报道利用氧化石墨烯建立 比色可视 传感器,检测前列腺特异性抗原(PSA)[47],测定过程见图6。
Shu课题组利用C60[C(COOH)2]2的过氧化物模拟酶催化活性建立葡萄糖比色传感器。该传感器的检测范围为1.0~40μmol/L,检测下限为0.5μmol/L[48]。Deng等发现GO@SiO2@CeO2纳米复合材料具有过氧化物模拟酶性质, 并研制了比色传感器,检测人体中葡萄糖、尿酸、乳酸和胆固醇[49]。Zhang等把带正电的金纳米粒子与单壁碳纳米管结合制备成复合纳米材料,发现该材料具有很强的过氧化物模拟酶活性,由此建立了一种标记型DNA杂交比色检测方法, 检测原理如图7所示[50]。Zhang等合成血红素-氧化石墨烯碳纳米管复合材料,利用它的过氧化物模拟酶活性制备一种新型传感器用于检测H2O2并联合检测抗坏血酸、多巴胺、尿酸和色氨酸[51]。Fang等合成了Pt@C核壳结构纳米材料, 制备了H2O2传感器。该传感器 的检测范 围为0.01~1.2 μmol/L,检测下限为0.002μmol/L[52]。
4 其他类型纳米材料的模拟酶性质及其应用
纳米结构的FeS同样作为无机模拟酶用于生物催化和生物传感[53]。Tremel等研究了V2O5纳米线的过氧化物模拟酶的催化活性[54]。Lu等通过L-精氨酸辅助水热法合成了具有过氧化物模拟酶活性的Co3O4纳米花。通过稳态动力学实验证 明其催化 活性高于 已报道的Fe3O4磁性纳米 颗粒[55]。Chen等发现CuO纳米颗粒具有过氧化物模拟酶的催化活性,其催化活性与反应体系的pH值、温度以及H2O2浓度密切相关,这些特征与辣根过氧化物酶表现一致[56]。Lv等发现牛血清蛋白(BSA)修饰的MnO2具有过氧化物模拟酶、过氧化氢模拟酶和氧化物模拟酶的性质[57]。该小组还利用水热法制备了一种水溶性较好的CeO2NPs,并利用它的过氧化物模拟酶的催化活性可视化检测了血清样品中葡萄糖的含量[58]。文献报道一些多金属氧酸盐也具有过氧化物酶活性,例如,H3PW12O40、H4SiW12O40、H3PMo12O40等在过氧化氢存在下也能催化TMB显色,可用于可视化检测过氧化氢[59]。
5 展望
纳米材料具有过氧化物酶催化活性的发现,开启了纳米人工模拟酶的研究领域。相对于天然酶,纳米颗粒模拟酶对酸、碱、温度的稳定性好,反应活性较高,易于对各类功能分子或蛋白质等进行修饰和标记,能够方便地应用于生物分析检测中。目前,所报道的纳米材料过氧化物酶活性只表现在生物体外,在生物体内的酶活性则未见报道。与体外环境相比,生物体内环境较为复杂。未来,纳米材料必将在生命科学和生物医药领域的研究中发挥更大的作用。
摘要：纳米材料模拟酶与天然酶相比,稳定性好,反应活性较高,易于对各类功能分子或蛋白质等进行修饰和标记,能够方便地应用于生物分析检测中。近几年,国内外的研究人员制备出各种各样的新型纳米材料模拟酶用于过氧化氢、葡萄糖、癌症标志物的检测。简要总结了近年来国内外磁性纳米粒子、金属纳米粒子、纳米合金等纳米材料模拟酶在比色分析及电化学传感器中应用的研究进展。
是酶合成调节, 还是酶活性调节? 第8篇
A.这些细菌是通过调节酶活性调节精氨酸合成的
B.这些细菌其精氨酸的合成是由3对等位基因共同控制的
C.产生了依赖中间产物Ⅰ的突变型细菌, 则很可能是酶1基因发生突变
D.若酶1基因不表达, 则酶2基因和酶3基因也不表达
很多学生对A项很疑惑:此图和教科书上讲的酶活性的调节和酶合成的调节似乎都不同, 酶活性的调节是代谢产物与酶结合, 通过改变酶的结构改变酶的活性, 此图很明显不是。而对于酶合成的调节教材上只讲了诱导物和基因共同控制酶的合成, 那么, 此图应该是哪一种调节方式?
原来酶合成的调节主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式。
一、酶合成的调节
1.酶合成的诱导。
诱导有协调诱导与顺序诱导两种。
(1) 协调诱导指诱导物同时或几乎同时诱导几种酶的合成, 如乳糖诱导大肠杆菌同时合成了半乳糖苷酶等。
(2) 顺序诱导是先后诱导合成分解底物的酶和分解其后各种中间代谢产物的酶, 顺序诱导对底物的转化速度较慢。
2.酶合成的阻遏。
酶合成的阻遏是微生物细胞阻止代谢中有关酶合成的过程, 主要有终产物阻遏和分解代谢产物阻遏。
(1) 终产物阻遏是指由于终端产物过量积累而导致代谢过程中某种或某些酶的合成受阻的现象。如上图细菌代谢合成的精氨酸达到一定量会阻遏酶1、酶2、酶3的合成, 使这些酶量减少, 精氨酸的合成速度也随之降低。这种现象常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等的合成过程中。当微生物细胞中的氨基酸、嘌呤和嘧啶过量时, 与这些物质合成有关的许多酶便不再合成。这就有效地保证了微生物细胞内一些重要物质的浓度, 避免原料和能量的浪费。
(2) 分解代谢产物阻遏是指某些易分解的物质的代谢产物能够阻止催化分解其他物质的酶的合成。如大肠杆菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时, 首先分解利用其中的葡萄糖而不利用乳糖, 当葡萄糖消耗完毕, 大肠杆菌才会利用乳糖。这是因为葡萄糖的分解代谢产物不存在了, 阻遏作用解除, 半乳糖苷酶被诱导合成。这种阻遏作用的意义在于当环境中存在易被利用的营养物质时, 微生物就可以不必耗费许多物质和能量去合成那些效益不高的诱导酶。
二、酶活性的调节
酶活性的调节是指微生物通过改变已有酶的催化活力来调节其代谢的过程, 主要有激活与抑制两种方式。
1.酶活力的激活常见于分解代谢的中间代谢产物促进了参与后面反应的酶活性, 以促使反应加快。
2.酶活力的抑制主要是指合成代谢过程的终端产物抑制了该过程中关键酶的活性, 对该代谢起到抑制作用。抑制大多属于反馈抑制类型。例如, 在黄色短杆菌合成赖氨酶、苏氨酸和甲硫氨酸的途径中, 当赖氨酸和苏氨酸过量时, 会协同抑制天冬氨酸激酶的活性, 使整个合成停止。这种调节可以避免细胞内某些代谢产物的合成过多而其他代谢产物的合成量不足。
综上所述, 本题中应该排除A, 不是酶活性的调节, 而是酶合成的调节, 答案选C。
练习:大肠杆菌以天冬氨酸为原料生产甲硫氨酸的代谢 (途径如图甲) 。用葡萄糖和乳糖作碳源培养大肠杆菌, 开始时, 大肠杆菌只利用葡萄糖, 只有当葡萄糖消耗完毕才开始利用乳糖合成代谢产物 (途径如图乙) 。下列说法正确的是 () 。
A.图甲属于酶活性调节, 图乙属于酶合成调节
B.图甲属于酶合成调节, 图乙属于酶活性调节
C.酶Ⅳ为诱导酶, 酶I、Ⅱ、Ⅲ、V为组成酶
D.酶I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为诱导酶, 酶V为组成酶
