木聚糖酶研究范文
木聚糖酶研究范文（精选12篇）
木聚糖酶研究 第1篇
木聚糖酶是一类能够特异降解木聚糖的酶类,主要是由β-1,4-D-内切木聚糖酶和β-1,4-D-外切木糖苷酶组成,此外还有一些脱支链酶。木聚糖酶能够降解木聚糖生成聚合度为2～10的低聚木糖混合物,该产物具有很高的经济价值,因此近年来,木聚糖酶在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域均显示了广阔的应用前景[2]。
木聚糖酶在去污洗涤,医药等行业中也有应用。另据报道,木聚糖酶在果实成熟、种子萌发、真菌的寄生及植物的抗性等诸多生理过程中也有重要作用[3]。
1 实验材料
1.1 菌株
好食脉孢霉(N.sitopHila),齐齐哈尔大学生命科学与工程学院生化工程实验室保藏提供,斜面(PDA)培养基保存。
1.2 主要仪器
电子天平(上海精密科学仪器有限公司),隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器厂),DL102电热鼓风干燥箱(天津市实验仪器厂),压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂),超净工作台(苏州净化设备股份公司),光学显微镜(Olympus),血球计数板(国营上海医用光学仪器厂),UV-120-02紫外分光光度计(日本津岛),酸度计(上海精密科学仪器有限公司),HYG-Ⅲ回旋式恒温调速摇瓶柜(上海新蕊自动化设备有限公司),电子万用炉(天津市泰斯特仪器有限公司),微量移液器(荆花)。
1.3 培养基
1.3.1 斜面培养基(PDA)
马铃薯200g去皮,切块煮沸30min,然后用纱布过滤,再加葡萄糖20g及琼脂20g,溶化后用水定容至1000mL,pH自然。
1.3.2 种子培养基:
3%麸皮水(麸皮水制备:3g麸皮加水100mL,浸泡1h,煮沸1h,过滤取汁、定容)、1.5%蛋白胨、pH5.0。
1.3.3 发酵培养基
3%麸皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然。
2 实验方法
2.1 培养方法
2.1.1 斜面培养
取好食脉孢霉一支,打开后用接种环转入PDA斜面培养基中,28℃恒温培养3d,放入冰箱中备用。
2.1.2 液体种子培养
向保存的好食脉孢霉斜面中加入5～10mL无菌水,然后用接种针将培养基表面的菌落刮下,转入带玻璃珠的三角瓶中,震荡摇匀,制成孢子悬液,用显微镜计数后,再取适量的悬液接入装有50mL液体培养基的250mL三角瓶中,使其孢子数达到105个/m L,于28℃,150r/min下震荡培养[4,5,6]。
2.1.3 液体发酵培养
将液体种子接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中,于一定的转速和温度的回转式摇床中培养,每个做三个平行样,并定时取样测定酶活力。
2.2 粗酶液的提取及酶活单位定义
将发酵液用滤纸真空抽滤后所得的清液,即为粗酶液。
酶活力定义为:在45℃,pH4.4条件下,每分钟分解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
2.3 木聚糖酶活力测定
木聚糖酶活力的测定常用方法有:Na3As O4法、液相色谱法、DNS法,其中最常用的为DNS法,本文采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)法[5,6]。
底物为0.4%木聚糖溶液(pH4.4),取0.5mL适当稀释的酶液于比色管中,加入1.5mL底物溶液,45℃水浴反应30min,加入1.5mL DNS溶液后在沸水浴中煮沸5min。迅速用冷水冷却至室温,加蒸馏水定容至25mL,540nm测定吸光值。
空白对照:取0.5mL适当稀释的酶液于比色管中,煮沸5min使酶失活,加入1.5mL底物溶液,45℃水浴反应30min,加入1.5mL DNS溶液后在沸水浴中煮沸5min。迅速用冷水冷却至室温,加蒸馏水定容至25mL,540nm测定吸光值。
液体木聚糖酶活力公式
X(mg):反应结束时酶水解底物产生的还原糖的毫克数;
Y(m L/g):酶的稀释倍数;
150.13(mg/mmol):木糖的相对分子质量;
30(min):反应时间(min);
0.5(m L):加入酶液量;
1000:将mmol转化成μmol所乘的系数。
3 影响酶活力的因素
3.1 培养基对酶活力的影响
以3%麸皮水为碳源,分别以0.5%蛋白胨、6%湿豆渣、1.4%豆粕、0.5%蛋白胨和6%湿豆渣及0.5%蛋白胨和1.4%豆粕为氮源,发酵温度为28℃,转速为150r/min,初始pH值自然进行发酵培养,选择接种量为3%,每组三个平行,发酵72h后测酶活。
3.2 接种量对酶活力的影响
发酵温度为28℃、转速为150r/min、初始pH值自然条件下,分别选择接种量为0.5%、1%、3%、5%、7%,每组三个平行,发酵72h后测酶活。
3.3 发酵温度对酶活力的影响
分别选取发酵温度20℃、25℃、28℃、32℃、转速为150r/min、初始pH值自然进行液体发酵,选择接种量为3%,每组三个平行,发酵时间为72h,测定各温度下的酶活力。
4 结果与讨论
4.1 种子培养
在温度为28℃,转速150r/min、初始pH值为5.0的条件下培养48h,每4h取样一次,烘干至恒重,测干重,各发酵时间的菌体干重如表4-1所示。
如表1所示,在12～32h后的种子培养液中菌体含量明显增多,适宜接种到发酵培养液中培养。
4.2 不同培养基对产酶的影响
培养基是提供微生物生长繁殖和生物各种代谢产物所需要的按一定比例配制的各种营养物质的混合物。
按表2配制发酵培养基进行发酵,温度为28℃,转速为150r/min,初始pH值自然。进行发酵培养,发酵时间为72h。
各发酵培养基的木聚糖酶活力,如表3。4号培养基木聚糖酶活力相对较高,但是总的来说酶活力低,无法用于实际生产中。从4号和5号培养基可以看出豆渣更适合为这个菌株提供氮源,所以决定由豆渣提供氮源,考虑加大培养基中氮源的量,即豆渣的含量,并且同时加入直接碳源葡萄糖,看直接碳源和氮源量的变化是否对菌株产木聚糖酶活力有影响。
豆渣含量不同的培养基木聚糖酶活力如表5。
如从表5所示结果,直接碳源葡萄糖对木聚糖酶活力没有影响,并且不加蛋白胨只加豆渣的培养基产的木聚糖酶活力是无法达到加入蛋白胨的培养基产的木聚糖酶活力的。所以,选择发酵培养基为3%麸皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然。
4.3 不同接种量对产酶的影响
接种量是指种子培养液体积和发酵液体积之比。本实验选取在温度为28℃、转速为150r/min、初始pH值自然条件下,分别选择接种量为0.5%、1%、3%、5%、7%进行发酵实验,在72h取样测酶活。本实验研究不同接种量对产酶的影响,木聚糖酶活力如表6。
如表6所示,接种量以1%最佳,此时产生的木聚糖酶活力最高。接种量过低,所需要的培养周期长,木聚糖酶活力降低;接种量过高,虽然培养时间缩短,但木聚糖酶活力达不到最佳值。
4.4 不同培养温度对产酶的影响
本实验分别选取发酵温度20℃、25℃、28℃、32℃、转速为150r/min、初始pH值自然进行液体发酵,发酵时间为72h。测定各温度下的酶活力如表7。
如表7所示,温度对该菌木聚糖酶的产生有显著影响。培养温度为25～28℃时,有利于木聚糖酶的合成,此时木聚糖酶活力较高。低于25℃时温度偏低,菌体生长较慢,产酶活力较低,所以选择在28℃下发酵。
5 总结
本实验研究表明合理的碳氮比对好食脉孢霉产木聚糖酶有很大的影响,合理的碳氮比有利于木聚糖酶的合成。
实验研究表明脉孢霉在3%麸皮水、1.5%蛋白胨、pH5.0的种子培养基中培养,摇瓶转速150r/min,发酵温度为28℃条件下培养12～32h后的种子培养液适宜接种到发酵培养基中。
液态发酵产酶培养基为:3%麸皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、p H自然。最适接种量为1%(v/v),最适发酵温度为28℃。
本实验用的好食脉孢霉菌种,相对产孢子多,菌体生长旺盛,但木聚糖酶的产量不是很高,有待于进一步对细胞破碎后木聚糖酶的活力进行研究。液态发酵接种量和温度的控制对木聚糖酶的产量有很重要的影响。
摘要：木聚糖酶在饲料、食品、纺织、造纸等行业应用广泛,是重要的工业用酶之一。利用丝状真菌—好食脉孢霉(N.sitopHila)为研究对象,以蛋白胨、豆渣、麸皮水和豆粕为底物进行液态发酵生产木聚糖酶,发酵后用滤纸真空抽滤后得粗酶液。用DNS法对脉孢霉半纤维素酶活力进行测定,对脉孢霉产木聚糖酶最优发酵培养基、接种量和培养温度进行研究,研究表明好食脉孢霉产半纤维素酶最适发酵培养基为3%麸皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然,最适接种量为1%,最适发酵温度为28℃。
关键词：木聚糖酶,好食脉孢霉,液态发酵
参考文献
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[3]侯炳炎.木聚糖酶及其应用[J].动物科学与动物医学,2002,19(4):52~53.
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木聚糖酶研究 第2篇
通过嗜热真菌DSM10635固体发酵生产木聚糖酶,探讨了利用该木聚糖酶-稀酸联合水解甜菜渣生产稀少五碳糖的方法,并对水解产物进行了定量分析.研究发现:通过木聚糖酶-稀酸水解甜菜渣可得到稀少单糖,主要有阿拉伯糖、葡萄糖、木糖等.HPLC结果显示:甜菜渣的`水解产物中L-阿拉伯糖含量占全部单糖含量的48.4 %(质量分数).实验结果为进一步研究L-阿拉伯糖的工业生产和精制奠定了基础.
作 者：张继泰 曾小英 付正 熊海容 Zhang Jitai Zeng Xiaoying Fu Zheng Xiong Hairong 作者单位：中南民族大学,生命科学学院,武汉,430074 刊 名：中南民族大学学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF SOUTH-CENTRAL UNIVERSITY FOR NATIONALITIES(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2009 28(4) 分类号：Q556 Q532 关键词：木聚糖酶 水解 甜菜渣 L-阿拉伯糖★ 中学生应对方式的初步研究
★ 家蚕转基因方法的初步研究
★ 对通货膨胀会计的初步研究
★ 海域使用后评价的初步研究
★ JMS-CCDAF-NF工艺去除水中腐殖酸的研究
壳聚糖的提取来源及方法研究 第3篇
关键词：壳聚糖；甲壳素；提取；制备；昆虫；微生物
中图分类号：TQ314 文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-04-0343-2
壳聚糖（chitosan，CTS）是甲壳素（chitin）经脱乙酰化处理后的产物，即脱乙酰基甲壳素，学名聚氨基葡萄糖，又名可溶性甲壳质，是甲壳素最基本、最重要的衍溶生物。
壳聚糖由于具有无毒副作用、可经微生物降解、良好的生物可容性和成膜性等优良特性，在轻工业、食品、医药卫生、环保、生物工程、农业等诸多领域得到了应用，随着各国对壳聚糖认识的不断提高和应用研究的进一步加深，壳聚糖也受到越来越多的关注。
甲壳素广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、蝇蛆和昆虫的外壳、贝类、软体动物的外壳和软骨，高等植物的细胞壁等。地球上每年甲壳素的生物合成量为数十亿吨，其中海洋生物的生成量在10亿吨以上，可以说是一种用之不竭的生物资源，是产量仅次于纤维素的天然高分子化合物。如何提取和制备品质优良的壳聚糖成为研究的首要问题。本文就壳聚糖的一些提取制备方法作一综述。
1 虾蟹甲壳提取
自然界每年生物合成的甲壳素有数10亿吨之多，其中虾壳中甲壳素的含量为20-25%，蟹壳中的含量为15-18%。目前甲壳素、壳聚糖的生产原料主要来自于虾蟹壳，将甲壳素脱去55%以上的乙醛基，就成为了壳聚糖。
1.1 高浓度碱在高温下脱乙酰得到壳聚糖
工业上一般采用浓碱热解法，提取制备壳聚糖，工艺流程[1]如下：
先将虾壳蟹壳清洗成净壳→4-6%的HCL溶液脱蛋白→粗甲壳质→0.5%的KMnO4溶液、1h→漂白水洗→60-70℃的1%苯酸、30min→水洗干燥→脱乙酰基甲壳质→140℃的5%NaOH溶液、1h→白色的壳聚糖。
但此法存在壳聚糖特性不稳定，对环境的污染严重，提取成本高等缺点[2]。
1.2 甲壳素酶法脱乙酰制备壳聚糖
甲壳素脱乙酰酶（chitin deacetylase,CDA）可以水解脱掉甲壳素上的乙酰基。接合菌纲（Zugomycetes）的Mucor rouxii和半知菌纲（Deuteromycetes）的Colletotrichum lindemuthianum中均发现该酶的存在，并可以纯化应用。此法可以替代现有的浓碱热解法生产壳聚糖，不但可以解决出现的环境污染问题，还可以得到乙酰化均匀、分子量分布范围窄的高质量壳聚糖。
但是，整体上从虾蟹壳中提取壳聚糖的方法仍存在着一些缺点。由于原料而受到地域和季节的限制；原料来源多样，品质参差，决定了产品品质的难以控制；虾蟹壳中还有大量的CaCO3，這给提取带来了一定的困难，同时也增加了成本带来了大量的废水，对环境造成污染。
2 微生物提取
目前从菌丝体中提取壳聚糖的研究较多，大致可以分为微波法、酸碱法和减法提取三种[3，4]。
彭益强等采用电解法和碱提取法从培养的猴头菇、平菇、黑曲霉等几种真菌湿菌体中制取壳聚糖，比较几种真菌的产品提取率，黑曲霉的几丁质、壳聚糖提取率最高，分别为20.8%、12.1%[5]。比较几种真菌的产品质量指标，黑曲霉最为理想[6]。
张涛等从日本根霉中提取壳聚糖，以酸碱法得到菌丝体干重为8.43g/L，壳聚糖为895mg/L，壳聚糖产率为10.58%，产品壳聚糖纯度高达90.5%，但是目前使用菌丝体生物量较低，前期发酵成本也相对比较高[7]。王传芬以废菌丝体为原料生产壳聚糖，研究确定了最佳脱乙酰基条件：50%氢氧化钠处理2.5h，固液比1：15，温度110℃，壳聚糖得率约为13%[8]。所得壳聚糖产品性能指标优良，达到食品级壳聚糖的要求。
可见，只有选育高产菌株，优化菌种培养条件，提高发酵生产量，才能有效地降低生产成本，进而推广大规模生产。利用微生物培养法生产甲壳素和壳聚糖可以大幅度减少环境污染，具有广泛的应用前景。
3 昆虫提取
甲壳素在昆虫体内分布广泛，在昆虫的原表皮层中含量最为丰富，约为25-60%[9，10]。不同的昆虫和不同的昆虫虫态甲壳素的含量不同。
3.1 臭蜣螂提取
研究发现，臭蜣螂体中甲壳素含量高出目前甲壳素生产常规原料虾蟹壳数倍，且从其体中提取的甲壳素与壳聚糖的品质在残留灰分、粘度和色泽等方面优于虾蟹壳[11]。
3.2 蝇蛆提取
蝇蛆属于再生资源，蝇蛆繁殖快产量大，据测算干蛆中含30-54.8%甲壳素。因此，从蝇蛆中提取的一种极有前途的抗菌活性蛋白后，再进行甲壳素的提取，脱乙酰基经研究将纯度较高的甲壳素将经50%的NaOH溶液，在60-65℃的水浴锅中加热8h，并重复以上实验两次，可以得到较好质量的壳聚糖[12]。
3.4 蚕蛹提取
蚕蛹分离油脂和蛋白质后的蛹壳,主要成分为甲壳素。以蚕蛹为试验材料,先经石油醚脱脂,再用NaOH处理脱除脱脂蚕蛹蛋白质,用HCl处理脱除蚕蛹无机盐，再经微波与浓碱液结合的方法脱除乙酰基制备壳聚糖[13，14]。
蛹甲壳素得率高，而且蛹壳聚糖的粘度高、分子量大，比虾、蟹壳的壳聚糖具有更好的应用前景。
西北农林大学的王敦等分别以蟋蟀[15]和金龟子[16]为研究对象，成功提取获得能溶解于稀酸的壳聚糖。关于松毛虫等其他昆虫中提取壳聚糖的也有报道，昆虫具有种类多，生物量大，繁殖速度快，富含甲壳素资源等特点，因为具有良好的资源潜力和开发优势，昆虫壳聚糖的开发也无疑具有广阔的前景，也会对整个昆虫资源的产业化具有一定的推动作用。
4 植物
4.1 桑白皮
杨迺嘉等首次报道了一种从桑白皮[17]中分离壳聚糖的简便方法。经碱醇液高温处理5h，壳聚糖收率为7.2%，具体工艺流程：
桑白皮→干燥粉碎过40目得桑白皮粉→1%CH3COOH加热提取三次→过滤得滤渣→碱—醇加热→过滤得滤渣→水洗至中性→2% HCl溶液，80℃浸提→过滤得滤液→调pH 10离心→湿壳聚糖→干燥得淡黄色壳聚糖粉末。
得到的桑白皮壳聚糖分子量较小,因而脱乙酰度虽然仅为 25%，却可溶于0.1N HCl，而蟹壳聚糖要脱乙酰度达70%以上才能溶于0.1N HCl。
从桑白皮中发现壳聚糖和甲壳素，为其作为新型生物医用材料，发挥其特有作用,提供了新的理论依据。
5 结论
壳聚糖的供不应求，造成了壳聚糖的旺销和价格的不断攀升。近些年来，随着对壳聚糖认识的不断深入，壳聚糖除了在传统的化妆品、保健品、食品工业得到应用并需求增加，在医药、化工、农业、畜牧业、纺织、环保等领域也发挥着巨大的作用。单纯依靠虾、蟹资源生产甲壳素资源，难以满足市场的需要，因此关于壳聚糖及其衍生物的提取制备的研究具有深远的意义。
参考文献
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[16] 王敦,胡景江,刘铭汤.从金龟子中提取壳聚糖的研究,西北林学院学报,2003,31(4):127-130.
木聚糖酶研究 第4篇
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种:
黑曲霉X-1 (Aspergillus niger X-1)[6],江西农业大学生物工程系应用微生物研究室自行分离保存。
1.1.2 培养基
斜面培养基和茄子瓶:马铃薯培养基(PDA培养基)。
产酶基础培养基:玉米芯粉5%,葡萄糖0.5%,(NH4)2SO4 0.1%,KH2PO4 0.5%,MgSO4·7H2O 0.1%,吐温80,1滴/瓶,pH 6.5。
1.1.3 原料、试剂
玉米芯:南昌市郊购得。
NaOH、浓HCl、浓H2SO4、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、苯酚、Na2SO3、酚酞、酒石酸钾钠、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、木糖、木聚糖(Sigma公司),所有试剂均为分析纯。
1.1.4 仪器:
722光栅分光光度计、DK-8D型电热恒温水槽、LXJ-IIB低速大容量多管离心机、大振幅恒温摇床、SB-JC-2B洁净工作台、LDZX-40II型立式自动热压力蒸汽灭菌器。
1.2 方法
1.2.1 发酵粗酶液的制备:
选取一支培养好的黑曲霉X-1菌种试管斜面制成孢子悬液,按8%接入产酶基础液体培养基,180r/min、30℃振荡培养5d,4 000r/min离心10min得上清液,即为粗酶液。
1.2.2 木聚糖酶活力测定:
采用DNS法[7]。
在40℃、pH 5.2的条件下,每mL待粗酶液每分钟水解木聚糖生成1μmoL木糖的酶量为1个酶活力单位(U)。
比活力(U/mg Protein):每毫克蛋白质所具有的酶活力单位为酶比活力。
2 结果与分析
2.1 发酵培养基的优化
2.1.1 碳源对产酶的影响
在产酶基础培养基中,选用不同的纤维性原料作为碳源,浓度为5% (W/V),结果图1表明,以纤维性原料为碳源都能够产生较多的木聚糖酶,其中玉米芯粉是最佳的诱导物,且在玉米芯粉中添加适量葡萄糖产酶效果更好。
1.玉米芯粉+葡萄糖;2.玉米芯粉;3.玉米芯木聚糖;6.蔗糖;7.葡萄糖;8.淀粉;9.木糖。
2.1.2 氮源对产酶的影响
以玉米芯粉和葡萄糖为碳源,添加1%不同氮源进行产酶试验。结果图2表明,培养基中氮源成分对黑曲霉X-1菌株液体摇瓶发酵产木聚糖酶的影响很大,有机氮源中蛋白胨为最佳氮源,无机氮源以(NH4)2SO4效果最好,且有机氮源均比无机氮源更有利于产酶,这与菌体在有机氮源培养基中,可直接利用水解后的氨基酸和其它有机氮化合物中的不同结构的碳架,来合成生命所需要的物质。还与有机氮源大都为缓释氮源有关,可以更好地控制菌体的生长速度,从而有利于产酶的积累。
2.1.3 KH2PO4浓度对产酶的影响
通常磷源是菌株生长及产酶的一个重要影响因素。因而在培养基中添加不同浓度的KH2PO4进行产酶实验,结果(图3)表明,液体培养基中KH2PO4浓度对产酶影响很明显,当KH2PO4浓度0.5%时,产酶效果最好,酶活达1 119.67U,比不加KH2PO4时酶活提高了641.75%,而KH2PO4浓度在0.3%～0.7%水平之间产酶变化不大,当KH2PO4>0.7%后对产酶产生负面影响,这可能与高浓度磷酸盐对菌体的抑制作用有关。
1.NH4Cl;2.NaNO3;3.NH4NO3;4.(NH4)2CO3;5.(NH4)2SO4;6.钼酸铵;7.尿素;8.蛋白胨;9.酵母粉。
2.1.4 培养基中C、N、P三因素优化
根据单因子试验结果,选取对黑曲霉X-1菌株液体发酵产木聚糖酶的最佳碳源(玉米芯粉和葡萄糖)、氮源(蛋白胨)和磷源(KH2PO4)采用四因素三水平的L9(34)正交试验(表1)。
结果经极差分析(表2)和方差分析(表3)表明,对产酶影响的次序是玉米芯粉>葡萄糖>蛋白胨>KH2PO4,实际较优组合为A2B2C3D1(即5号试验组合),而理论较优组合为A2B2C2D1。玉米芯粉和葡萄糖对其产酶的影响达到了极显著水平,而蛋白胨和K2HPO4对其影响不显著。
为了验证实际最佳条件与理论最佳条件,进行试验比较,结果得到实际最佳条件木聚糖酶酶活力为1 328.32U,而理论最佳条件木聚糖酶酶力为1 390.98U。所以最后选用理论最佳配方,即玉米芯粉3.0%、葡萄糖0.5%、蛋白胨1.0%、K2HPO4 0.3%。
2.1.5 无机盐对产酶的影响
采用0.1%浓度不同的无机离子进行产酶试验,结果图4表明,添加0.1%浓度的MgSO4对黑曲霉X-1菌株产酶效果最好,酶活达1 357.12U,而CuSO4、MnSO4对产酶有一定抑制作用。
2.1.6 Tween-80对产酶的影响
表面活性剂有增加细胞膜透性、提高酶的稳定性和催化能力。木聚糖酶的生物合成受到诱导阻遏机制的调节,因此提高细胞膜透性,使得细胞合成的酶蛋白及时分泌到胞外,有望提高菌体的产酶能力。在培养基中添加不同浓度的Tween-80进行液体摇瓶发酵对产酶的影响试验,结果图5表明,液体发酵养基中添加Tween-80对黑曲霉X-1产酶有一定影响,添加适量Tween-80对黑曲霉X-1产酶有促进作用,当Tween-80浓度为0.1‰时效果最佳,酶活高达1 404.44U,比不添加Tween-80产酶(1 279.34U)提高了9.78%。
2.1.7 培养温度对产酶的影响
不同温度对供试黑曲霉X-1菌株进行液体发酵培养产酶试验,由图6可以看出,供试黑曲霉X-1菌株发酵产酶的最适温度为30℃。
2.1.8 初始pH值对产酶的影响
通常培养基的初始pH是菌株生长及产酶的一个重要的影响因素。利用0.2mol/L NaOH和HCl将培养基调节成不同pH值(自然pH为5.5)进行产酶试验,结果见图7。结果表明:培养基中初始pH对黑曲霉X-1菌株液体摇瓶发酵产木聚糖酶有一定影响,pH 6.5时,黑曲霉X-1菌株液体摇瓶发酵产木聚糖酶最高,酶活达1 361.65U。
2.1.9 不同装料量对产酶的影响
采用优化后的液体发酵培养基,利用250mL三角瓶按不同装料量进行产酶试验,结果见图8。结果表明,液体培养基装料量的多少对黑曲霉X-1菌株发酵产酶有一定影响,250mL三角瓶装量为50mL时,黑曲霉X-1菌株液体发酵产酶效果最好,酶活达1 416.79 U。
2.1.10 不同孢子接种量对产酶的影响
将斜面孢子用无菌水配成孢子悬液(孢子浓度为6.8×107个/mL),在50mL液体发酵培养基中接入不同的种子量(以mL计),图9结果可以看出,不同接种量对黑曲霉X-1液体发酵产酶的影响不是很明显,接种量为6%(即4.08×106个孢子/mL培养基)时黑曲霉X-1液体摇瓶发酵产酶效果为最佳,酶活为1 479.34U。在一定的产酶培养基中,接种量过低,所需培养周期延长,木聚糖酶活力降低;接种量过高,虽然培养时间缩短,但木聚糖酶活力达不到最佳值,这可能是因为接种量过高时,在发酵培养初期底物和其他营养成分被过多的消耗而不利于酶的合成,从而影响了木聚糖酶活力。
2.1.11 不同转速对产酶的影响
采用优化后的液体发酵培养基,最适装料量和接种量,调整不同转速进行液体摇瓶发酵产酶试验,结果(图10)表明,在液体培养时,摇床转速对黑曲霉X-1菌株液体发酵产酶的影响不甚明显。其中200r/min是黑曲霉X-1菌株产酶的最适转速,酶活达1 445.60U。
2.1.12 优化后产酶曲线的测定
采用优化后的摇瓶培养基和发酵条件,在发酵过程中每隔12h取样,测定其木聚糖酶酶活、DNA含量、pH、总糖含量、还原糖含量、磷含量、氨基氮含量、蛋白质含量和比酶活。结果见图11。
图11结果表明,在液体培养过程中,在生长初期,菌体以营养生长为主,培养基中的还原糖被快速消耗,72h后还原糖消耗速率减小;总糖在0～36h内有所下降,而36h后又有所回升;而磷源和氨基氮基本保持缓慢上升趋势;菌体在0～72h内表现生长较快,到72h达到稳定生长状态;在相应培养时间0～48h内产酶较少,而在48～72h之间,产酶快速增长,蛋白质也随之升高,随后增长速度显著下降,到120h产酶和蛋白质均达到高峰,酶活达1 630.78U,蛋白质为3.33mg/mL,120h以后略有所下降;同时发酵液的pH在生长及产酶的初期阶段快速下降,并在72h后稳定在3.5左右,可推测该木聚糖酶为酸性酶。
3 讨论
3.1 以作者实验室自行筛选保存的产木聚糖酶黑曲霉X-1为试验菌株,分别采用单因素和正交试验对该菌株的液体发酵工艺进行了优化。优化后的液体发酵工艺条件为:玉米芯粉3%,葡萄糖0.5%,蛋白胨1%,KH2PO4 0.5%,MgSO4·7H2O 0.1%,Tween-80 0.1‰,pH 6.5,30℃、200r/min摇瓶培养120h,木聚糖酶活力高达1 630.78U。比优化前木聚糖酶活(724.63U)提高了125.05%。虽然实验室液体摇瓶数据显示菌株具有很好的发酵潜力,但更大规模的中试还有待于研究,以及其后续木聚糖酶的分离、提纯、酶制剂的制备和应用等工作也值得进一步研究。
3.2 利用黑曲霉X-1菌株发酵生产木聚糖酶效果好且附加值高,发酵生产木聚糖酶所需原材料主要是玉米芯等廉价的农副产品,目前玉米芯大多未被合理利用,常常被废弃而造成环境污染,可见,以玉米芯为原料生产木聚糖酶具有重要的社会效益及经济价值。
摘要：目的:提高黑曲霉X-1菌株液体发酵木聚糖酶的产量。方法:采用单因素和正交试验对黑曲霉X-1菌株产木聚糖酶液体发酵培养基和培养条件进行了优化。结果:通过正交试验找出最大影响因素为玉米芯和葡萄糖的供应,优化后的最佳培养基和培养条件为:玉米芯粉3%,葡萄糖0.5%,蛋白胨1%,KH2PO40.5%,MgSO4.7H2O 0.1%,Tween-80 0.1‰,pH 6.5,30℃、200r/min摇瓶培养120h。结论:黑曲霉X-1菌株在优化后的培养基和培养条件下,木聚糖酶活力高达1630.78U,比优化前木聚糖酶活力(724.63U)提高了125.05%。
关键词：黑曲霉X-1,木聚糖酶,液体发酵工艺
参考文献
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木聚糖酶研究 第5篇
甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究
采用PCR的.方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组DNA为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN.重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22.将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU/ml,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究.
作 者： 作者单位： 刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 26(7) 分类号：Q786 关键词：甘露聚糖酶 毕赤酵母 表达微生物制备壳聚糖酶的研究进展 第6篇
关键词：微生物 壳聚糖酶 壳寡糖 发酵
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）10-0002-01
1973年，Monaghan等在研究细菌和真菌过程中，首次提出壳聚糖酶的概念。1992年壳聚糖酶被系统命名为EC3.2.1.132。2004年，国际酶委员对壳聚糖酶重新定义为：一类催化氨基葡萄糖间的β-1，4-糖苷键断裂，从而专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，壳聚糖酶的发现可克服壳聚糖生产成本高和溶解性的缺陷，从而转化为溶解性更优越、溶液稳定性更强、生物活性更丰富的壳寡糖，这就成了现今研究的热点方向。作者结合近年来国内外壳聚糖酶的研究成果，综合分析了壳聚糖酶的分类、性质和制备方法等研究现状。
1 壳聚糖酶概述
壳聚糖酶目前有3种分类方法[3]：底物专一性差别和酶的产生特点。根据底物专一性差别，壳聚糖酶可以分为三类，第一类可以水解GlcN-GlcN键及GlcNAc-GlcN键；第二类只能水解GlcN-GlcN键；第三类既可水解GlcN-GlcN键，又可水解GlcN-GlcNAc键。根据酶的产生特点，可以将壳聚糖酶分为组成型和诱导型。
壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，其最適pH值范围一般在4.0～8.0。酶的等电点（pI）变化范围大多集中在4.0～10.1。壳聚糖酶具有较好的热稳定性，最适反应温度在30～60℃。研究发现金属离子尤其是重金属离子对壳聚糖酶活性有不同程度的影响。大部分壳聚糖酶属于内切酶，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物，壳聚糖酶在酶解过程中的活性是随着N-乙酰化度、N-取代基团及其不同取代位置以及均相和非均相反应体系而变化的。
2 壳聚糖酶的微生物制备方法
2.1 微生物液体发酵
目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，因此当以壳聚糖作为唯一碳源时，微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。一般的液体发酵步骤是通过平板分离初筛和摇瓶培养复筛，从土壤中筛选出产壳聚糖酶菌株，然后经酶活力检测比较，挑选出产酶能力最强的菌株作为产酶试验菌。当然也可通过人工诱变处理来获得高产突变株，最常用的方法是化学法和物理法诱变，可采用单因子诱变处理和复合因子处理。目前对于壳聚糖酶的分离纯化方法主要有（NH4）2SO4分级盐析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离等方法。酶活单位定义为每分钟催化生成相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。测定壳聚糖酶最常用的方法是DNS法，此外还有粘度法快速测定法和铁氰化钾显色法。对已筛选出的产壳聚糖酶菌种的鉴定一般包括①形态学特征鉴定；②生理生化特性鉴定；③16S rDNA序列分析。由于壳聚糖酶的稳定性不高、寿命短、且无法循环使用，在生产中的应用受到了极大限制，但是通过固定化后上述缺点都可以解决。
2.2 丝状真菌固态发酵
工业上固态发酵是生产酶制剂的主要方式，对于菌丝体有利于保持其自然生理状态和生长，所用培养基和发酵条件更加低廉和简单，而且投资较少；纯化步骤少，产品纯度高，是丝状真菌的一种理想培养方法，糖化工业中以常见的根霉菌丝体替代纯壳聚糖为诱导原料。
2.3 基因工程育种
除了在自然界中继续筛选产酶活性较高的微生物菌种外，现在越来越多的研究人员利用基因工程通过对产壳聚糖酶菌株的基因分析，运用分子方法克隆并高效表达所选菌种的壳聚糖酶基因，以实现重组菌的壳聚糖酶高效表达，具体技术路线如下：根据所选菌株壳聚糖酶基因序列或参照其他菌株的壳聚糖酶基因序列→PCR引物设计，引物合成→提取所选菌株总DNA→PCR扩增获得目的基因→构建原核表达载体→重组菌高效表达条件研究→壳聚糖酶高效表达。
3 研究展望
继续筛选产酶活性较高的微生物菌种的过程中，要合理运用新的诱变方法或进行复合诱变，以减小菌种对诱变方法的抗性，从而获得高产菌株。另外，对发酵条件也要进行优化和改进，筛选出最佳产酶条件，以获得最大的产酶量。另一方面，应该紧跟国际前沿，进一步在分子水平上研究壳聚糖酶的分子结构和作用机制，以便更有效地克隆细菌壳聚糖酶基因，构建能高效表达壳聚糖酶的工程菌株，对酶分子进行定向修饰，从本质上提高壳聚糖酶的活性与稳定性，加速其应用的大规模实用化和产业化。
参考文献
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木聚糖酶研究 第7篇
木聚糖是在自然界中含量第二丰富的可再生生物资源, 由多聚五碳糖构成, 是组成植物半纤维素的重要组分。木聚糖酶是一类复合酶系可将木聚糖降解成低聚糖和木糖, 来源广泛, 主要水解β-1, 4–糖苷键, 其水解方式是随机的。木聚糖酶可以分解原料的细胞壁和β-葡聚糖, 降低物料的粘度, 促进有效物质的释放, 降低多淀粉多糖, 促进营养物质的吸收, 因而更易取可溶性脂类成分[1]。
长期以来, 人们一直认为纸浆漂白中最实惠最有效的漂白剂是氯, 然而随着人们环境保护意识的日益增强, 含氯漂白废水中所含的氯化有机物对环境的危害也逐渐引起了人们的关注, 尤其是在生产过程中对大气和水资源的污染及其严重。随着全球对纸的需求量和对造纸废液排放要求的提高, 全无氯和无元素氯漂白是纸浆漂白的新方向, 这就给木聚糖酶助漂的发展提供了非常好的机遇。本文从木聚糖酶性质分类, 作用机制, 研究现状及应用进行介绍, 并对其在纸浆工业中的应用前景进行了展望。
1 木聚糖酶的概述
1.1 木聚糖酶的性质
木聚糖酶 (xylanase) 是能够专一将半纤维素木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一组酶系的总称。目前国内外对于木聚糖性质的研究主要集中在细菌和真菌上。对于细菌来讲所产生的木聚糖酶蛋白质亚基较单一, 大体可分为耐酸木聚糖酶和耐碱木聚糖酶两类。真菌木聚糖酶分子量大小差异较大, 蛋白质亚基比较复杂。大多数情况下, 细菌所产的木聚糖酶的耐热性比真菌稍好一些, 最适温度在50~60℃之间, 真菌的最适温度在50℃左右。各种来源的木聚糖酶的等电点一般在3~10之间[2]。
1.2 木聚糖酶的分类
广义的木聚糖酶主要由β-1, 4–外切木聚糖酶, β-1, 4–内切木聚糖酶和β-木糖苷酶这三类组成。而仅限于内切β-1, 4–木聚糖酶的称之为狭义上的木聚糖酶, 主要对木聚糖主链的骨架进行降解。另外, 根据催化区域的氨基酸序列和疏水性的不同可将糖苷水解酶分成不同的家族, 木聚糖酶被归为第10家族 (F家族) 和第11家族 (G家族) [3]。
1.3 木聚糖酶的作用机制
许多酶的协同作用, 才可以使木聚糖完全降解, 其中内切木聚糖酶和外切木糖苷酶起主要作用。作用于木聚糖和长链木寡糖的是内切木聚糖酶, 对木糖苷键的切割部位主要在其主链的内部, 低聚木糖、木寡糖、木二糖等为主要的水解产物;外切木糖苷酶作用于木聚糖和木寡糖的非还原端, 其产物为木糖[4]。由于大多数木聚糖是异质多糖中的一种, 其结构复杂, 具有高度分枝且取代基种类繁多, 因而生物降解木聚糖需要一个复杂的酶系统, 其中多种组分通过相互协同作用来降解木聚糖。
2 木聚糖酶在纸浆中的研究
2.1 木聚糖酶预处理改善纤维性能的研究
为达到改善纸浆性能的目的可以用木聚糖酶对稻草进行预处理。在研究不同用量的酶对酶预处理效果的影响中, 提高蒸煮得率、浆料强度方面漆酶优于木聚糖酶, 但对改善浆料白度方面木聚糖酶预处理则优于漆酶。另外, 通过协同作用将木聚糖酶与漆酶进行漂前预处理, 可使在进行次氯酸盐漂白时的麦草浆具有更好的可漂性。
木聚糖酶处理纸浆不仅可以降低能耗、改善打浆性能, 而且还可以改善纤维成纸性能。经研究发现, 纤维的内部和外部均发生细纤维化, 柔韧性增加, 改善了纤维压缩性, 使纸页微孔性下降, 密度和透明度升高。在漂白麦草浆时使用黑曲霉的内切木聚糖酶, 可以达到改善麦草浆的滤水性能、提高裂断长度、降低纸浆的脆性等目的, 尤其是混合使用时加入纤维素酶效果更为明显[5]。
2.2 木聚糖酶降解己烯糖醛酸的研究
己烯糖醛酸属于不饱和羧酸化合物, 在碱法蒸煮过程中, 植物纤维原料中木聚糖的4-O-甲基葡萄糖醛酸由于高温强碱的作用, 通过β-甲醇消除反应, 在六元环上形成不利于纸浆漂白操作的双键, 是碱性硫酸盐浆及其漂白废液中糖醛酸的组成部分之一。
纸浆中的半纤维素可以通过处理过的木聚糖酶降解, 己烯糖醛酸通过对半纤维素中木聚糖的支链基团4-O-甲基葡萄糖醛酸的蒸煮过程中而形成, 所以理论上可以认为减少纸浆中己烯糖醛酸的含量, 改善纸浆性能, 可以通过处理木聚糖酶而实现。李海龙[6]等人为达到降低纸浆中的己烯糖醛酸含量的目的, 用处理后的木聚糖酶处理纸浆。结果表明, 降低纸浆中己烯糖醛酸的含量可以通过木聚糖酶处理。通过处理过的木聚糖酶可使麦草浆、桉木浆和三倍体毛白杨浆中的己烯糖醛酸的含量降低, 桉木浆中己烯糖醛酸降低量最大。
2.3 木聚糖酶水解木素—聚糖复合体的研究
植物纤维原料中一部分木聚糖是以木素-木聚糖复合体的形式存在, 木聚糖酶可水解在木素-木聚糖复合体中的木聚糖链, 释放复合体中的木素与碳水化合物。用纸浆纤维中的半纤维素被木聚糖酶降解, 使得纤维细胞壁结构变得疏松, 木素更容易被抽提出来, 用显微镜观察纤维断面发现, 经木聚糖酶和甘露糖酶处理后, 细胞壁发生润胀而结构疏松[7]。
3 木聚糖酶在纸浆工业中的应用
3.1 在纸浆漂白中的应用
在纸浆漂白方面木聚糖酶应用也十分广泛, 但目前尚不完全清楚其在纸浆中助漂的机理, 酶并不是直接漂白纸浆而是通过改变纸浆的化学性质来辅助漂白。对木聚糖酶辅助漂白的机理科学家们进行了大量的研究, 提出了四种助漂机理假设:第一, 可使在蒸煮过程中沉积在纤维表面的木聚糖有效地降解, 利于漂剂与木质素更好的接触, 脱出更容易;第二, 纤维细胞壁结构在木聚糖酶的作用下变得疏松, 从而更容易抽提木质素;第三, 与纸浆中残余木质素有连接的半纤维素可被木聚糖酶降解, 增大纤维间的孔隙, 从而有利于木质素的脱除;第四, 在蒸煮过程中产生的衍生物-己烯糖醛酸木聚糖可被木聚糖酶有效地除去。此外, 碱法制浆中二次沉淀在纤维表面上的木聚糖被溶解, 使漂白效果提高。
硫酸盐纸浆通过木聚糖酶的处理不仅能增强漂白效果, 而且还可以降低后续漂段的用氯量, 葛培锦[8]等人经研究发现在碱法制备麦草浆时, 经木聚糖酶预处理后的原料可使麦草浆H2O2的漂白效率得到较好地改善。综上所述, 木聚糖酶的预漂白技术可以降低造纸业对环境的污染, 是未来制浆和造纸工业的一个重要发展方向。
3.2 在废纸脱墨中的应用
在化学药剂和一定的温度及机械作用下, 纤维就可以废纸脱墨回收利用。顾琪萍等[9]研究发现与对照浆相比, 酶法脱墨浆的白度和残留油墨量分别高出3.2%和降低73.8%, 且与化学脱墨相比, 得率较高和返黄值较低。由此说明与化学法脱墨相比酶法脱墨有较好的可漂性, 或达到同样的白度, 其所用的漂白药品相对较少, 故能达到减轻废水的污染负荷, 利于环境保护的目的。
3.3 在溶解纸浆中的应用
由牛皮纸或硫酸盐纸经过进一步精制和纯化而得到的高纯度纤维素浆的过程称作溶解纸张, 再一步发生衍生反应可以使多种可溶性衍生物形成, 纤维性材料如各种人造丝、纤维脂或塑胶等均可利用这些可溶性衍生物生产得来。生产中对纸浆的溶解纯度要求极高, 通过处理含有纤维素酶活的木聚糖酶, 可以达到除去残留的木聚糖的目的, 但其纸张的粘合力却下降很多。要在除去部分木聚糖的同时, 完全保持纸浆粘度, 就需要采用不含纤维素酶活的木聚糖酶处理, 大大方便随后的碱液抽提工作[5]。
3.4 在树木剥皮中的应用
木材制浆的第一步是树木剥皮, 需要耗能巨大。必须彻底剥皮才能生产出高质量的化学浆和机械浆, 如果剥皮后可能还有极少量树皮的残留, 制得的纸浆也会变黑, 成纸的物理性能和光学性能均受到影响。树皮和木材之间的形成层是一层活细胞, 向内输送木质细胞, 向外输送韧皮细胞。由于树木中的半纤维素含量最高的部分在韧皮部, 所以剥皮效果最好的方法是木聚糖酶法。
3.5 在生物化学制浆中的应用
目前工厂广泛利用生物预处理技术, 当纸浆的硬度相同时减少制浆使用的化学品用量和能耗, 或是在不减少化学用品的条件下使纸浆的硬度降低, 达到适应无氯漂白, 减轻环境污染的目的。冯建良[10]等研究发现, 在相同的工艺条件下, 麦草通过木聚糖酶预处理后, 使原料的脱木素程度提高了, 纸浆的卡伯值降低了, 蒸煮的用碱量减少了, 并使浆的得率提高了2.4%, 白度提高了8.8%。因此, 在生物化学制浆上应用木聚糖酶可以提高原料的制浆性能、减少能耗。
4 木聚糖酶应用的展望
如今在很多领域均能体现出木聚糖酶的应用价值, 但其缺点也同时存在, 如使用效率低、稳定性差、半衰期短等, 改良后的木聚糖酶的比活性扩大了同时降低了应用成本, 使其在纸浆工业中应用更广泛。人们为木聚糖酶更广泛的应用将在以下几个方向进行研究:第一, 对酶优良菌株, 嗜极微生物菌种进行筛选, 建立一个完善的木聚糖酶菌种资源库, 使菌种酶基因的表达量和产品的性能提升。第二, 采用现代生物技术、基因工程和蛋白质工程等手段, 对功能间的分子层次和木聚糖酶的结构关系进行深入的研究, 改造木聚糖酶基因, 使其稳定性和抗外界不良条件的抗逆性提高, 研发新品种。第三, 系统、深入地开展木聚糖酶在纸浆工业中应用的研究, 以此应用领域的特殊要求为根据, 有针对性地创造最佳的反应条件, 使木聚糖酶的作用最大限度地发挥出来, 提高纸品的亮度, 增强纸品的光滑度, 增大纸品的柔韧度, 改进纸品对油墨的吸收性和抗水性, 降低生产成本, 使其在造纸工业中的应用必将为制浆造纸工业的发展发挥巨大的推动作用。
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木聚糖酶研究 第8篇
木聚糖酶已成功地用于饲料生产和纸浆漂白,并在可再生资源的生物降解过程中具有重要作用[2,3]。在大多数生物降解过程中,耐热木聚糖酶起着减少微生物污染的作用。由于自然耐高温木聚糖酶的可用性是有限的[4,5],且蛋白是三维结构,人们一直试图通过突变方法改进木聚糖酶的热耐受,但是大部分功能的变化超出目前的预测能力,因此定向进化的方法得到了应用。
酶分子的定向进化不需要事先了解酶的空间结构和催化机制,人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化机制(随机突变、基因重组、自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择(或筛选)出所需性质的突变酶。易错PCR(error-prone PCR,epPCR)技术是在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时,通过调整反应条件[如提高酶离子浓度,改变体系中4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度等]改变Taq酶的突变频率,从而向目的基因中以一定频率引入突变,构建突变库,然后选择或筛选需要的突变体[6]。
西北农林科技大学动物科技学院分子生物学实验室将从造纸厂土壤中得到的耐碱木聚糖酶基因xylBYG(NCBI登录号为EU927699)构建到表达载体上,并在枯草芽孢杆菌中成功表达,对其理化性质进行了较全面的探讨。但该酶还存在一些缺陷,如耐高温和热稳定性不够优秀,对于某些特殊要求还不适用。本研究旨在利用易错PCR 等体外分子定向进化技术,对该木聚糖酶进行分子改良,筛选耐高温的稳定突变体,使其能够应用于生产实际。同时通过分析所获得的突变序列和结构,了解木聚糖酶结构与功能的关系。
1 材料
1.1 菌株和质粒
E.coli BL21感受态细胞、耐碱木聚糖酶基因xylBYG,西北农林科技大学动物科技学院分子生物学实验室前期保存;质粒PGME-T载体、pET-32a(+)载体,购自美国 Promega公司。
1.2 酶和试剂
各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶,购自美国 Promega公司;溶菌酶、简单型 PCR 反应系统,均购自 Tiangen 公司; DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒,购自Omgea 公司;琼脂糖、琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨,购自宝泰克公司;木糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、TRIS盐酸缓冲液、溴化乙锭(EB)、氨苄西林,购自南京建成生物工程公司;DL-2 000 Marker、DL-5 000 Marker、6×Loading Buffer、PCR反应系统、dNTP,均购自 TaKaRa 公司。
1.3 培养基
LB培养基,按 Invitrogen 公司操作手册推荐方法配制。
2 方法
2.1 易错PCR扩增木聚糖酶xylBYG基因片段
根据xylBYG木聚糖酶基因序列,使用 Primer Premier 5.0软件设计 epPCR引物。在引物的末端分别引入限制内切酶EcoRⅠ和 SacⅠ酶切位点(下画线部分),并分别在 5′端增加 3～5个保护碱基,以便于后期的克隆与表达。上游引物为5′-GCGGCCGAATTCATGAATTTGAGAA-3′,下游引物为5′-TCGGCGGAGCTCTTAGTTGCCAAT-3′。epPCR反应体系(25 μL):模板(xylBYG质粒)1 μL,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.5 μL,10×Buffer 2.5 μL,Mg2+ 2.5 μL,Mn2+ 2.5 μL,GoldenDNA酶 0.3 μL,上、下游引物各2 μL,ddH2O 10.2 μL。其中Mg2+ 为3～7 mmol/L;Mn2+为0.3～0.8 mmol/L;dATP和dGTP为1 mmol/L;dCTP和dTTP为7 mmol/L,可以得到不同突变频率的文库。epPCR循环条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,62 ℃退火1.5 min,72 ℃延伸1.5 min,共34个循环,72 ℃延伸 15 min;4 ℃保存。
2.2 突变文库的构建和筛选
对于第1轮的epPCR,编码木聚糖酶基因质粒xylBYG被用作模板。对于第2轮的epPCR,2个含有从第1轮筛选的有益突变的质粒为模板。epPCR扩增产物经 DNA 纯化试剂盒纯化后, 用限制性内切酶EcoRⅠ和SacⅠ分别对epPCR扩增产物和质粒pET-32a (+)进行消化、连接,电转化至E.coli BL21感受态细胞,涂布于LB(含100 μg/mL的Amp) 平板,于37 ℃培养12 h后,挑选具有插入片段的克隆,组成突变体库。
挑选突变体转移至96孔板中,加200 μL LB (含100 μg/mL的Amp,1 mmol/L IPTG)液体培养基,37 ℃、220 r/min培养24 h;将诱导表达的96孔板发酵液经1 800 r/min离心 10 min;弃去上清液,用50 mmol/L磷酸钠缓冲液30 μL重悬细胞沉淀(pH值为7.6)。经上述步骤后,在65 ℃将含有第1轮epPCR产物的96孔板发酵液培养2 h;在70 ℃将含有第2轮epPCR产物的96孔板发酵液培养2 h;加入50 μL含1%木聚糖的磷酸钠缓冲液(50 mmol/L),37 ℃培养2 h后测定酶活[7];最后加入120 μL DNS试剂终止反应,105 ℃显色20 min;1 800 r/min离心 10 min;将上清液转移至另一个96孔板中,测定 OD540 值。
2.3 耐高温木聚糖酶突变位点分析和结构预测
耐高温突变体经鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因测序,然后与野生型酶基因进行比对,同时在 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找同源序列并进行比对,根据比对结果选择结构模拟的模板,在SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/) 数据库中输入目的蛋白的氨基酸序列和模板的PDB编号,生成模拟结构[8,9],根据预测的结构信息分析其位点突变效应。
3 结果与分析
3.1 易错PCR条件的确定
由于 Mg2+在 PCR 过程中可以稳定非互补的碱基对,Mn2+能够降低聚合酶对模板的特异性,因而调整2种离子的浓度可以获得不同突变频率的多样性文库。本研究选择3～7 mmol/L Mg2+,0.3～0.8 mmol/L Mn2+作为梯度进行epPCR。将Mg2+浓度由小到大编号为A1(3 mmol/L),A2(4 mmol/L),A3(5 mmol/L),A4(6 mmol/L),A5(7 mmol/L);Mn2+由小到大编号为B1(0.3 mmol/L),B2(0.4 mmol/L),B3(0.5 mmol/L),B4(0.6 mmol/L),B5(0.7 mmol/L),B6(0.8 mmol/L),并按如下搭配:B1A1,B1A2,B1A3,B1A4,B1A5;B2A1,B2A2,B2A3,B2A4,B2A5;B3A1,B3A2,B3A3,B3A4,B3A5;B4A1,B4A2,B4A3,B4A4,B4A5;B5A1,B5A2,B5A3,B5A4,B5A5;B6A1,B6A2,B6A3,B6A4,B6A5。
PCR 结果见图 1。
1.B6A5;M.DL-2 000 Marker。
从图 1 可知,使用B6A5搭配,即Mg2+最适浓度为7 mmol/L、Mn2+最适浓度为0.8 mmol/L时效果最佳。
3.2 易错PCR突变文库的构建及筛选
3.2.1 从第1轮易错PCR突变体库筛选耐热性提高的突变体
从第1轮epPCR库随机挑取约60%的克隆子显示木聚糖酶的活性,在65 ℃热处理2 h后,野生型xylBYG完全灭活。共对3 000个突变体进行了筛选,结果表明,酶耐热性的改善可能会影响酶的催化活性,共筛选出了2个提高耐热性但对酶活影响不大的突变体,在热处理试验后,这2个突变体保留了40%的酶活性。突变体02C05、13A09包含了2个氨基酸的替换。在第1轮筛选中,共有4个氨基酸替换,T52I、G112D、M54I和A98V可能有利于增强xylBYG耐热性。
3.2.2 从第2轮易错PCR突变体库筛选耐热性提高的突变体
以突变体02C05、13A09作为第2轮epPCR的模板,约对4 500个突变体进行筛选。第1轮的epPCR氨基酸替换随机结合,其结果显示协同作用的影响[10],见图2。
由图2可见,出现了1个新的有益的氨基酸替换 E120D,包含于突变体37D07(E120D /A98V/ T52I /G112D),只含有从第1轮的epPCR继承氨基酸替换的突变体23E06(A98V/M54I/G112D),见表2。
3.3 突变木聚糖酶温度稳定性和酶最适温度
通过对野生型木聚糖酶xylBYG和突变体木聚糖酶的相对残留酶活的测定来分析二者的热稳定性。将各待测酶液稀释至 10 mg/L,在不同温度下热处理20 min后,取样置于冰上 25 min,取一定量酶测定其相对残余酶活,结果见图3。当温度达到60 ℃时,野生型木聚糖酶xylBYG已丧失90%相对酶活力,突变体酶23E06和37D07还保留80%相对酶活力,而在第1轮epPCR中产生的突变体02C05和13A09则保留50%相对酶活力。
酶最适温度的测定:是将待测液在不同温度下热处理5 min,然后取样置于冰上 25 min,取一定量酶测定酶活,结果见图4。从图4可见,野生型木聚糖酶xylBYG最适温度为55.0 ℃,第1轮epPCR中产生的突变体02C05和13A09的最适温度为63.0 ℃,而突变体37D07的最适温度为68 ℃。突变体木聚糖酶的最适作用温度同野生型相比提高了13 ℃,同时酶活也提高了约17%。
3.4 木聚糖酶的结构预测和突变位点分析
耐高温突变体经鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因测序。将突变体的基因与野生型酶基因进行比对,然后在 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找同源序列并与突变体的基因进行比对,就生成模拟结构的模板,根据模板的PDB编号和目的蛋白的氨基酸序列,在SWISS-MODEL数据库中生成突变体的三维模拟结构,见166页彩图5。根据模拟三维结构及其生成的信息,分析其位点突变效应。
氢键、疏水相互作用、静电跨相互作用是决定蛋白质耐热结构的主导因素。第1轮epPCR产生氨基酸替换T52I可能与Pro102产生额外的疏水相互作用;氨基酸替换M54I可以使Ile54与Tyr96之间的疏水相互作用替代Met54与Phe74之间的疏水相互作用。氨基酸替换G112D可以与Lys137产生额外的氢键,此外这种替代还可能与His26和Lys137产生新的盐桥,这将使蛋白质二级结构更加稳定。在第2轮epPCR产生新的氨基酸替换E112D可以与Asp125产生新的氢键,可能会对蛋白质产生一定的作用。但具体的突变带来的效应机制和热稳定性相关的结构还需要进一步深行研究和探讨。
4 讨论
定向进化能够快速鉴定适应性突变,以最小的序列变化产生大的表型差异,从而使氨基酸序列差异与蛋白质功能差异之间的真正相互关系变得明朗,相当大地简化了序列比较、分析工作。定向进化可行性的一个前提就是合理地控制突变文库的大小。对定向进化来说,合适的突变频率是每个基因2～5个碱基替换。 试验选用的epPCR程序简单、快速,而且最重要的是其突变频率可被确切控制。epPCR过程中突变率一般为每个基因1.5～5个碱基[6]。西北农林科技大学动物科技学院分子生物学实验室自主克隆到1株耐碱性木聚糖酶基因xylBYG,该基因开放阅读框为687 bp,成熟蛋白质仅228个氨基酸残基,适合做epPCR研究(<800 bp)[11]。epPCR主要通过调整Mn2+和Mg2+的浓度和使用不平衡的4种碱基浓度来控制突变频率。Mg2+的作用是稳定非互补的碱基对,Mn2+的作用是降低聚合酶对模板的特异性,其浓度的增加是为了稳定非互补的碱基对。本试验中选择0.8 mmol/L Mn2+和7 mmol /L Mg2+的条件获得了较好的结果。
本研究中,xylBYG基因经2轮进化后,共有 5 个碱基发生了突变,其中转换多于颠换,表明在epPCR过程中,碱基的突变确实具有一定的偏向性;T、C 间的转换多于 A、G 间的转换,可能与epPCR过程中 dCTP 和 dTTP 2种脱氧核苷酸的含量高于其他两种有关。本研究采用的96孔板微量滴定法是液态酶活测定最常用的一种成熟方法[12],是最普遍的适于自动化、高通量的筛选方法,筛选的结果非常可靠。该方法的主要优势在于在测定过程中,液态酶活的体积可以减少,并且还可以从背景中区分低溶度的、弱活性的酶表达克隆。多孔板结合分光光度计测定酶活的高通量筛选是目前最常用的筛选方法之一,增加了筛选的通量,节约了筛选的时间。
突变木聚糖酶温度稳定性和酶最适温度测定的结果表明,突变体木聚糖酶的最适作用温度同野生型相比提高了13 ℃,同时酶活也提高了约 17%。热稳定性测定结果也表明,突变体热稳定性也相应提高。从本研究结果可以看出,epPCR可在一定程度上改善木聚糖酶的最适作用温度、酶活、热稳定性等酶学性质。但是,由于 epPCR 本身所固有的缺陷,大幅提高耐热性还存在一定的困难,因此可以在此突变株的基础上进一步结合其他定向进化方法,如DNA shuffling或理性设计来进一步提高酶耐热性。
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壳聚糖化学研究现状 第9篇
壳聚糖 (Chitosan) 俗称脱乙酰甲壳素;化学名称是 (1, 4) -2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖, 分子式为 (C6H13NO5) n;CAS登记号为9012-76-4。其结构是如图所示:
1 壳聚糖的来源及制备方法
壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物, 自然界中来源广泛。甲壳素大量存在于如下:真菌及藻类细胞壁 (猴头菇、香菇) , 节支动物 (虾、蟹) , 动物骨骼, 昆虫外壳 (蟋蟀、蝇蛆、蚕蛹) , 软体动物内壳和软骨 (乌贼、鱿鱼) , 高等植物的细胞壁 (桑白皮) , 腔肠动物 (海哲) , 抗生素和酶的酿造副产物 (日本根霉) 。
壳聚糖是甲壳素重要的降解产物, 目前壳聚糖制备工艺有三种:碱溶法、碱液法、综合生产法。三种工艺的工艺流程包括但不限于清洗、酸浸、碱处理、脱乙酰、脱色及干燥工序;关键步骤是三脱, 即为脱钙、脱蛋白、脱乙酰。通常, 脱钙工艺采用稀盐酸溶液, 而脱蛋白、脱乙酰工艺则采用氢氧化钠溶液。
2 壳聚糖的性质
2.1 壳聚糖的三大重要参数
壳聚糖有三个重要参数:脱乙酰度、分子量及其分布、结晶度。脱乙酰度或转化率是指乙酰化与脱乙酰化产品之间的转化程度, 工业可用壳聚糖脱乙酰度至少达到75%;脱乙酰度主要取决于反应温度及辅助物用量;脱乙酰度直接关系到壳聚糖的溶解与结晶性能。壳聚糖的分子量分布从几十万到几百万, 分子量及其分布对壳聚糖材料的成纤性、强度等性能有着直接影响。结晶度对壳聚糖的降解速率和材料性质有明显作用, 壳聚糖的晶型结构因溶液酸碱性而发生转化。
2.1 壳聚糖的溶解性及其影响因素
壳聚糖分子链上存在大量的羟基和氨基, 从而容易形成众多氢键而使得壳聚糖形成更加稳定有序的排列, 且大量的活性基团被包裹, 因此壳聚糖难溶于一般的溶剂。一般壳聚糖脱乙酰度>50%的中、高密度壳聚糖难溶于中性水, 可溶于稀盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸, 但不溶于稀硫酸和稀磷酸;还溶于某些离子液体中, 已用于溶解壳聚糖的离子液体有咪唑类与甘氨酸类[4]。
可见溶解性是制约壳聚糖研究及应用的因素之一, 而影响壳聚糖溶解的主要因素则包含了脱乙酰度、相对分子质量、溶剂的种类、温度等。
3 壳聚糖的改性研究
壳聚糖具有无毒性、无刺激性、相容性、降解性、吸湿性、抗菌性、成纤成膜性、安全性、保湿性、保鲜性等特性, 但是受其溶解性能等因素的制约, 壳聚糖的发展应用受到极大的限制。因此, 对壳聚糖进行化学修饰来提高其应用范围已经成为壳聚糖工业的一个重要发展方向。
壳聚糖中大量存在2位氨基、3位仲羟基、6位伯羟基以及糖苷键。对这些官能团进行衍生或结构修饰得到各种功能性物质。已有研究报道的壳聚糖化学改性反应[4,5,6,7]主要有醚化反应、酰化反应、酯化反应、氧化反应、O-糖苷化反应、磺原酸化反应、交联反应、N-烷基化反应、席夫碱反应、接枝共聚、羧基化反应、降解反应、两亲性改性反应、壳聚糖支链化反应、还原性烷基化反应、螯合吸附等。在聚壳糖主体结构不变的基础上, 上述反应对活泼官能团进行选择性的反应得到性质不同的产物, 进而增加壳聚糖新的应用空间。
4 壳聚糖及其衍生物的应用
壳聚糖有着诸多优异特性, 因此, 壳聚糖在化工 (催化剂载体、重金属脱除剂、原材料) 、医药 (壳聚糖缓释体系、纳米胶囊、药用辅料、抗肿瘤药物、支架涂层) 、水处理 (净水剂、沉降剂) 、食品 (澄清剂、亚硝酸盐消除剂、保鲜剂、防腐剂、包装膜、脱色剂) 、化妆品 (保湿剂、润肤剂、面膜) 、纺织 (固色剂) 、保健品 (提高免疫力、抗衰老、降血压) 、生化、环保 (絮凝剂、螯合剂) 、塑料、酶载体以及生物医学工程等领域有着广泛的应用及应用前景[8,9,10,11]。因此, 壳聚糖及其衍生物的开发应用及市场发展前景较为可观, 对它进行深入研究和利用, 应用领域也将逐渐扩大。
摘要：壳聚糖是自然界大量存在的碱性多糖, 本文从壳聚糖的来源、性质、改性、应用几个方面进行概述, 为壳聚糖的工业发展提供支撑。
关键词：壳聚糖,来源,改性,应用
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壳聚糖应用研究进展 第10篇
1 壳聚糖在医药方面的应用
由于壳聚糖安全、无毒副作用,与生物器官有良好的相容性,并在降解的过程中不会产生任何有毒单质,还能为细胞生长提供所需的三维支架作用,能提供类似软骨基质的细胞外环境,维持细胞表型及功能,因此它最早被用在医学方面。Hermann Ehrlich[1]等研究了双重薄膜散布系统中磷酸钙晶体在壳聚糖薄膜中的生长过程,研究证明磷酸钙化的壳聚糖对骨组织的修复和重生具有重要的应用价值;段亮等[2]研究了壳聚糖短纤维增强聚己内酯复合材料的体内生物相容性问题,该材料作为胸壁缺损修补材料应用于临床具有可行性和安全性;S.Santhosh等[3]研究了壳聚糖对由异烟肼、利福平导致的肝中毒的保护作用,表明壳聚糖的这种保护作用主要是归因于其的解抗脂肪及抗氧化作用;倪有娣等[4]进行了用凝胶化改性壳聚糖抑菌及抗腹腔感染作用的研究,证明凝胶化改性壳聚糖不但对一般性感染菌具明显的抑制作用,对腹腔感染也具一定的预防作用,且能抑制白色念珠菌的生长。壳聚糖也被广泛的用于制药方面,壳聚糖最终可被降解为无生物毒性的低聚糖,使壳聚糖有望作为药物储存、输送的载体,主要用于传送亲水性大分子如疫苗、多肽、蛋白质及某些抗肿瘤药。同时壳聚糖及其衍生物作为絮凝剂可有效地保留药液中的有效成分,保持制剂的稳定性;降低药液中的重金属离子含量,具有良好的生物相容性和成膜性,是中药辅料的理想材质。Tze Wen Chung等[5]研究了填充在FLCM(fib-rin encapsulated li.posome-in-chitosan matrix)胶囊内的水溶性药物在体内的传递与释放,表明该胶囊中药物的释放时间比只填充在脂质体内的药物的释放时间要长4倍,可达l7d;王梅等[6]研究了低分子壳聚糖季铵盐对牛血管平滑肌细胞增殖的影响,实验证明,低分子壳聚糖季铵盐呈浓度依赖性的抑制血管平滑肌细胞增殖。杨红梅等[7]以壳聚糖、阿拉伯胶为缓释材料制备烟酸占替诺缓释片并进行处方筛选,结果表明该品在体外有很好的缓释效果;王立强等[8]用新合成法合成较高巯基含量的壳聚糖巯基醋酸耦合物,并进一步评价其各项性能,实验表明巯基含量的增加可提高壳聚糖巯基醋酸耦合物的多项生物学性能。
2 壳聚糖在生物技术方面的应用
由于壳聚糖既有一定的通透性能,又具备良好的物理机械性能,兼有优良的生物学性能,壳聚糖是一种很好的功能膜材料。利用壳聚糖制备缓释、控释制剂已取得了较好的效果[9]。
2.1 药物缓释材料
药物缓释技术出现于80年代,具有反应轻、副作用小,疗效长等特点,以此作为药物载体有极大的优越性,不仅毒性低,且在低的p H下的凝胶状态容易被生物吸收,并具有抗酸、抗溃疡的能力,可阻止或减弱药物在胃中的刺痛作用。此外,在酸性环境中壳聚糖基质能形成漂浮并逐渐膨胀。这些特点使壳聚糖成为一种理想的药物缓释材料。许多药物如抗菌素、抗病毒、抗炎性等药物加入到薄膜中,使用时将其植入患病处或通过口、鼻、黏膜给药。这样药物会在一个较长的时间内慢慢地释放出来,以达到持续给药的目的,以加强疗效。
2.2 固定化酶载体
壳聚糖的氨基对各种蛋白质的亲和力非常高,用壳聚糖制成的多孔膜和多孔微球颗粒[10]可作为酶、抗原、抗体等生理活性物质的固定化载体。壳聚糖以戊二醛等作交联剂可被许多酶固定化,如壳聚糖可与α-糜蛋白酶、乳酸酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶等固定。以壳聚糖为载体将木瓜蛋白酶固定化可用于啤酒的澄清[11]。壳聚糖与其他天然纤维、再生纤维、合成纤维比较,对于血浆蛋白的γ-球蛋白具有更高的固定性能,且原料易得,价格低廉,能在温和的条件下将酶固定,固定酶的效率高,这种固定化酶可以长期保存,反复使用。
3 壳聚糖在饲料添加剂方面的应用
壳聚糖具有降低胆固醇、降低体脂沉积、增强免疫作用、抑菌杀菌作用等多种生物学功能,且无毒无害,可被生物体完全吸收,因此壳聚糖作为一种新型绿色饲料添加剂具有广阔的开发前景[12]。
目前,壳聚糖降脂、降胆固醇功能已在家禽研究中得以证实,但机理尚不清楚;免疫增强作用、抑菌杀菌作用等其它生物学功能已在体外试验或小鼠试验中验证,而在畜禽试验中的研究较少。因此壳聚糖作为一种畜禽新型绿色饲料添加剂,仍有待于进行全面系统研究。
4 壳聚糖在农业方面的应用
壳聚糖及其衍生物在农业上的应用,是壳聚糖应用的一个新的领域。壳聚糖可用作种子的处理剂和叶面喷肥。激发种子发芽,提高植物抗逆,抗病能力,促进生长提高产量。在许多作物上应用,取得良好成效。利用壳聚糖的抗菌能力和改善土壤的能力,可将壳聚糖与可溶性蛋白合成液体土壤改良剂,制成杀菌剂。
5 壳聚糖及其衍生物在化工方面的应用
5.1 环保和水处理工艺上的絮凝剂
壳聚糖作为絮凝剂和吸附剂用于水处理工艺中的研究取得了巨大进展。其原因是常规使用的无机或有机絮凝剂,尽管有效,但由于常规用量大、处理成本高,或者是残留物毒性大易造成二次污染。因而开发无毒、安全、价廉、无二次污染的絮凝剂就成了世界性大课题。壳聚糖在上述几个方面有着得天独厚的优势,且能生物降解。
壳聚糖因其独特的分子结构,是天然多糖中惟一大量存在的碱性氨基多糖。因而具有一系列特殊功能性质,壳聚糖分子中含有羟基乙酰氨基和氨基决定了其具有特殊的吸附作用,其分子量及脱乙酰度的不同对其吸附能力有着一定的影响。
近几年,对壳聚糖做了以下几方面的研究:(1)作为澄清剂在中药制剂中的澄清吸附;(2)一些物质的吸附;(3)分子量及其脱乙酰度的测定。
5.2 轻纺工业上的印花媒染剂
壳聚糖对织物、皮革、纤维等均有良好的亲合性。它不仅具有牢固的吸着力,而且也具防皱和耐磨性,可以做媒染剂和织物整理剂。
5.3 化妆品工业上的优良添加剂
壳聚糖经有机酸和磺酸处理后形成的衍生物,具有良好的吸湿性、成膜性、防静电和防尘性,且对皮肤无毒、无刺激性[13],因而在化妆品工业上被广泛用来制香波、润肤剂、固发摩丝、护发素、香皂等,其用量可因目的不同而异。
5.4 造纸工业上的应用
壳聚糖的成膜性和化学结构特性可以使纸张纤维间耐水性键得以加固,从而提高纸张表面强度和内在强度,并提高表面平滑度和抗水性[14]。如纸表面用1%壳聚糖处理后,纸张的抗撕力强度和耐折性大大加强,但不影响纸的亮度。国内造纸工业已用处理纸张,使质量明显提高。
6 壳聚糖及其衍生物在环保材料上的应用
壳聚糖及其衍生物通过和其他材料的共混改性,在环境友好功能材料方面,开发出绿色涂料、可食性包装材料以及多种可完全降解的生物材料。
7 结语
木聚糖酶研究 第11篇
关键词：金雀异黄素；壳聚糖；纳米粒子；释放动力学；释放速率常数
中图分类号： R944文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0280-03
收稿日期：2014-12-20
基金项目：江苏省研究生科技创新计划（编号：CXZZ13_0893）；江苏省2012年度“青蓝工程”资助项目。
作者简介：陈圆（1981—），女，江苏泰兴人，博士，副教授，研究方向为药物新剂型。E-mail：jstzchenyuan@163.com。
通信作者：张龙（1966—），男，江苏靖江人，教授，研究方向为药物新剂型，E-mail：longz98@163.com；刘天晴（1959—），男，江苏淮安人，博士，教授，研究方向为胶体与界面化学，E-mail：tqliu@yzu.edu.cn。目前，药物释放研究大致可分为混合药膜体系和大分子药物体系，其中，前者是使药物物理分散在生物大分子中，即用生物大分子来包裹药物，这类药物在溶出过程中必须通过生物大分子载体，并在载体完全降解后才得以全部释放；而后者是通过可降解生物大分子与药物分子之间化学相互作用形成化学键，这类药物释药必须通过酶解或水解来进行。
壳聚糖（chitosan）[1-4]作为一种天然生物材料，因其具有良好的生物相容性和可降解性，在医药领域的应用研究中，已成为新型的纳米药物载体。金雀异黄素是一种存在于豆科植物中的天然异黄酮化合物，具有广泛的抗肿瘤药理活性。文献[5]研究了金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的制备与性能表征，发现该纳米粒子不仅具有良好的负载能力，还具有良好的缓释性能。然而，金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的具体释药模型还有待进一步阐释。目前，药物体外释放模型归纳起来可分为动力学模型、概率分布模型、多项式模型、Logistic模型、Gompertz模型、Higuchi模型等。本研究运用常用的零级动力学[6]、一级动力学[7]、Higuchi动力学[8-10]和双相动力学模型对金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放进行拟合，探讨其释放动力学行为。
1试验部分
1.1试剂
乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司产品），磷酸盐缓冲液（Sigma公司产品），金雀异黄素（99%，上海融合医药科技发展有限公司产品），金雀异黄素壳聚糖纳米粒（自制），去离子水。
1.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放性能测定
采用透析法研究不同介质pH值和离子浓度对金雀异黄素纳米粒体外释放性能，释放试验同文献[5]所述，用UV-2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）测定所取样液中药物的含量，进而计算累积药物释放量（Q）。
1.3金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放动力学研究
运用零级动力学、一级动力学、Higuchi方程和双相动力学方程，对金雀异黄素对照品和金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放数据进行模型拟合，考察药物释放的动力学方程和释放速率常数。
2结果与分析
2.1金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放性能研究
前期研究结果显示[5]，金雀异黄素对照品的体外释放几乎与释放时间呈线性关系，在7 h内释放量Q达94%，之后释放量趋于稳定；而其壳聚糖纳米粒子在释放12 h内释放量Q达到64.38%，在60 h后释放量Q达到96.07%。说明金雀异黄素壳聚糖纳米粒子具有明显的缓释效果，释放开始的前12 h内，纳米粒子中药物浓度与释放介质的浓度梯度较大，释放速率较快；而随着浓度梯度的减小，释放速率也相应减小。
在pH值 5.8、6.2、6.6、7.0、7.4条件下，金雀异黄素壳聚糖纳米粒子释放60 h后，累积释放量分别为97.7%、91.4%、90.7%、86.6%、85.6%，即随着释放介质的pH值增大，纳米制剂的药物释放量减少（图1）。在pH值5.8的介质中释放10 h的释放率为87.2%，而在pH值7.4的介质中10 h后释放率则为60.4%，表明金雀异黄素壳聚糖纳米粒子对介质pH值具有一定的响应性。这可能是因为纳米粒子的壳壁是由壳聚糖与三聚磷酸钠离子交联形成，当释放介质的pH值越大时，阴离子浓度越大，与带正电荷的壳聚糖因为电荷作用相互吸引，使得药物释放的速率减缓。
图2为金雀异黄素壳聚糖纳米粒子分别在离子浓度为0.02、0.04、0.08 mol/L的释放介质中的释药行为。从图2可以看出，释药10 h后的释放率分别为55.5%、71.6%、78.8%，而在60 h后的释放率则分别为85.6%、90.5%、97.8%，即随着释放介质中离子浓度的增大，纳米粒子的释放速率和释药量相应增大，表明金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的释药率与介质离子浓度有关。这可能是因为介质中离子浓度
越大，与纳米粒子内部越容易形成较大的浓度差，介质溶液就越容易进入纳米粒子内部而将药物溶出来。
2.2金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放动力学研究
由图3可知，金雀异黄素对照品的一级动力学方程[ln（1-Q）=-0.311 4t]、Higuchi动力学方程（Q=0.305 4 t1/2）和双相动力学方程（Q=1.657 9-0.838 1e-0.105 39t-0.838 1e-0.105 35 t）的拟合优度R2分别为0.958 0、0.866 4、0.970 0，而零级动力学方程（Q=0.122 1t）的拟合优度为0.981 9，更接近1，说明金雀异黄素的体外释放更符合零级动力学方程，呈线性释放，释放速率常数为0.122 min-1。
nlc202309020107
由图4可知， 金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的零级动力学
方程（Q=0.020 0t）、一级动力学[ln（1-Q）=-0.041 7t]和Higuchi动力学（Q=0.134 6t1/2）的拟合优度R2分别为0.862 1、0.947 8和0.881 2，拟合度都不是很好；而双相动力学方程（Q=0.874 9-0.789 3e-0.110t-0.093 3e-0.032t）的拟合优度为0.998 8，接近于1，说明金雀异黄素纳米粒的体外释放更符合双相动力学方程，先快速释药，后缓慢释放，2相的释放速率常数分别为0.110、0.032 min-1。这可能是释药前，由于纳米粒表面吸附了金雀异黄素，所以释药较快，使得药物到达靶部位后可迅速释放出较多药物，达到较高浓度；而随着释放的进行，包裹在纳米粒内部的药物因为载体材料的溶解逐渐被释放出来，释药速率相对较慢，维持药效，这样的释药行为有利于提高药物使用率。
3结论
金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放行为与释放介质的pH值和离子浓度有关。通过对释药数据模型拟合可知，金雀异黄素对照品体外释放速度较快，符合零级动力学方程，呈线性释放；而双相动力学方程更符合金雀异黄素壳聚糖纳米粒子的体外释放规律，这种先快速释药、后缓慢释放的释药行为有利于提高药物的使用率。
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魔芋葡甘聚糖的研究利用 第12篇
关键词：魔芋,魔芋葡甘聚糖,魔芋资源开发
随着科技的发展和世界人口的增长以及人们生活水平的提高, 人们越来越认识到一些新资源如魔芋的食用及药用等价值[1]。魔芋球茎中具有生物活性和生理功能的是魔芋葡甘聚糖 (KGM) 和生物碱[2], 目前人们研究利用的主要为葡甘聚糖。
1 魔芋葡甘聚糖 (KGM)
魔芋干物质的主要成分为葡甘聚糖。KGM为白色粉末。魔芋加工后的精粉一般含葡甘聚糖65%以上, 提高技术含量可使精粉中葡甘聚糖含量达到80%左右。华中农业大学、武汉大学魔芋研究课题组的研究人员, 利用生化技术, 得到含量达95%以上的高纯度KGM[4]。
魔芋葡甘聚糖是一种天然高分子化合物, 具有高吸水性、高膨胀性, 溶于冷水后, 会形成一种粘稠的溶胶, 可起增稠、乳化和悬浮的作用;若使其pH值小于12.2, 则可形成可逆性的凝胶;使pH值大于l2.2并进行加热, 则形成一种弹性凝胶, 这种特性在其它多糖中是罕见的[3]。
2 KGM的应用
利用魔芋提取的葡甘聚糖及其加工产品的研究与开发已引起农业、食品、医药等行业研究机构和企业的重视。
2.1 KGM在食品工业的应用
KGM是一种水溶性膳食纤维。它的胶凝性、粘结性、成膜性、可溶性、增稠性和保水性等特点, 使其成为一种天然食品原料、添加剂和保鲜剂。
2.1.1 KGM在食品防腐保鲜中的应用
利用KGM具有的成膜性, 可以制成具有抑制病菌和霉菌功能、透明度和致密度高的薄膜。罗学刚以其为原料, 制成的可食性KGM包装薄膜具有良好的耐水性、耐热性、可分解性, 较好的拉伸强度, 百分伸长率, 耐折度和透明度[5]。张其昌、史益敏等成功地把魔芋胶薄膜应用于柑桔和温州蜜桔的保鲜中[6]。也有研究者在保鲜龙眼时, 在其表面涂上魔芋精粉膜, 保持了龙眼的固有品质[7]。
KGM不仅可以用来保鲜果蔬[8], 在肉类的保鲜中也具有良好效果。殷涌光等用KGM和其它物质配制成保鲜液喷在鲜肉表面, 保质期较同等条件下对照组相应延长了6~8d。该法不仅可降低成本, 而且没有冻肉解冻时所产生的液汁流失现象[7,8,9]。余清、庞杰将一定比例的辣椒红色素与KGM混合, 利用KGM的成膜特性, 提高了色素的稳定性, 进而提高食品和饮料产品的质量, 节省了生产成本, 提高了产品的档次[10]。
2.1.2 KGM在食品添加剂中的应用
KGM具有乳化、增稠和稳定的性能, 有着极高的粘度, 是所有天然胶中最高者, 且与黄原胶、卡拉胶等有协同增效作用。将以上几种食用胶与单甘酯、磷酸盐等混合可复配成冰淇淋乳化稳定剂, 提高冰淇淋、雪糕的抗融能力, 改善了冰淇淋、雪糕的口感[6]。丁金龙、孙远明等以魔芋胶 (微细化的魔芋精粉) 与大豆分离蛋白为试材, 发现魔芋胶与大豆分离蛋白复配具有明显的协同增稠作用;魔芋胶对低浓度大豆分离蛋白的乳化性能具有显著的改善作用[11]。
在小麦面粉中加入魔芋胶溶液, 可提高小麦面粉的表观面筋值。由于胶粘性, 加有魔芋胶的通心粉、空心面、龙须面、拉面、馄饨皮等, 用开水煮后不浑汤。同时, 也由于魔芋胶的持水性, 使上述小麦面粉制品口感柔软, 增加了制品的弹性和韧性[6]。
除此以外, 作为增稠剂、稳定剂, 它可用于面包制品、蛋糕、饮料和配制型酸奶等食品生产中[7]。
2.2 KGM在医药行业的应用
高纯度KGM在医药上可作为药品的新资源, 还可作为药物的载体、填充剂、外科敷料、粘合剂、缓释剂等。
2.2.1 KGM在减肥、降血糖、抗癌、降血脂方面的应用
KGM本身是一种低热能、高膳食纤维的天然食品, 在进食后KGM吸水膨胀后使人产生饱腹感, 每次进食量不会过多。且KGM在胃中不被消化, 进入肠道后被消化并能促进肠系酶类的分泌与活化[3], 增加肠道的功能, 并能抑制小肠对水分的吸收及肠壁水分被吸收进肠道, 起到通便作用。KGM通过与谷类食物的联合作用, 能增加谷类碳水化合物在肠道中的不吸收程度, 从而降低机体对谷类碳水化合物的吸收利用[12], 从而达到减肥效果[3]。
KGM对预防和治疗糖尿病有疗效。由于KGM能减少及减缓糖在肠内的吸收, 食用后可减轻胰岛负担, 改善糖耐量, 降低血糖[13]。
KGM可降低血清胆固醇, 其降血脂效果优于其它的膳食纤维。KGM能在消化道内与胆固醇等结合, 阻碍中性脂肪和胆固醇的吸收, 从而降低了肝脂, 增加类固醇的排出量;它能在结肠内被微生物发酵分解, 产生丙酸等短链脂肪酸, 这些短链脂肪酸被人体吸收, 从而产生降血脂作用。另外, 长期食用魔芋可延缓脑神经胶质细胞、心肌细胞和静脉内膜内细胞的老化过程, 预防动脉粥样硬化, 改善心、脑和血管的功能[3,13]。
研究发现KGM能起到明显抑制移植性肿瘤生长的作用, 且新鲜魔芋茎块煎剂和魔芋灰粉 (提取精粉后的渣粉) [14]也具有与KGM相同的作用。人们对KGM对肿瘤的抑制作用及对免疫功能的影响研究的更活跃。KGM对MNNG诱发肺癌可产生不同程度的抑制和预防作用[15]。在对KGM的抗癌临床研究中发现, KGM制品对甲状腺癌、子宫颈癌、鼻咽癌、肺癌、食道癌等均有一定的疗效。
KGM的抗癌机理可能是KGM作为一种食物纤维能刺激机体产生一种杀灭癌细胞的物质, 增强淋巴细胞的转化率[14];它还可改变肠道菌群的生态环境, 促使以双岐杆菌为代表的厌氧菌占优势, 而该类活菌具有明显增强免疫的作用, 其死菌亦有明显地抗肿瘤活性[3,15]。
2.2.2 KGM在作控制释放材料等方面的应用
在医药行业, KGM可用作药物控制释放研究, 有研究者用KGM包埋“狄布卡因” (Dibucaine) 及用KGM释放“颅通定” (Rotundine) , 都达到了不同程度的控制效果。KGM同半乳甘露糖共混制备的凝胶材料可用于药物控制释放, 也可对KGM处理后制作栓剂基质和缓释药片, 或作为亲水性的药物缓释体系。KGM凝胶还可用作片剂药物包衣。由KGM制成的人工晶体可用于制作隐形眼镜和医疗光学制品和医用光学设施[16,17]。
2.3 KGM在其它行业的应用
KGM及其改性物质在印染、建筑、涂料、纺织和造纸、环保、农业等产业领域得到广泛地重视, 成为研究的热点之一。
在纺织工业方面, 可做毛、麻、棉纱的浆料和丝绸加工的浆糊料、柔软剂。有人对丙烯酰胺与KGM接枝共聚进行研究, 得到的共聚物是很好的涂料印花增稠剂[18]。把KGM与聚乙烯共混研制出聚烯烃树脂复合双降解材料。用改性的KGM制成的活性染料印花清晰、着色均匀、着色量高、无痕、无脱色、无堵网等疵病, 糊料洗脱性能好[17]。
在石油工业方面, KGM可用于钻井泥浆改性。由于KGM膨胀力大, 粘着力强, 可做高级粘着剂。近年, 应用于石油钻探, 大大加固了井壁, 提高了工程质量。
由于KGM具有良好的生物相容性、吸湿性、亲水性和可生物降解性, KGM可制成高吸水材料, 或用于研制高强度的纸张和各种具有强吸水性能的专用纸。加入甘油和防腐剂等也可制成具有很好的润滑和保湿作用的护肤品[17]。
在建筑方面, 经聚合反应而得KGM建筑胶粘剂, 可配制成水性涂料以替代耐水性差的内墙涂料及各种干粉涂料, 涂层硬度高, 光泽好, 耐水洗, 不龟裂。KGM还可用作防尘剂, 防止在施工中产生灰尘[17]。
在生物技术方面, 改性KGM还可制成色谱填料, 或通过不同的活化处理, 用于多种酶的固定化[17,18]。
在农业方面, 以KGM和聚乙烯醇进行共混流延成环境友好的农用地膜, 此膜具有良好的机械性能, 透明度高, 且具有完全生物降解性[19]。
KGM可被用于化学农药及化肥的缓释剂。交联的KGM包裹化肥, 使化肥缓慢释放。由改性KGM与渗透剂、分散剂等辅料组成的液状种衣成膜剂, 可制成不同作物使用的、不同用途的种衣剂, 起到保水、保湿及有效成分的缓释作用。而且通过KGM凝胶的缓释作用可将包埋在其中的杀菌剂缓慢释放出来防止藻类生长, 提高生物利用率[17]。
在环保方面, KGM经磷酸盐酯化后可以成为一类新型有机高分子絮凝剂。将它应用于含水溶性丝胶蛋白的煮茧废液的处理, 结果较为满意[20]。
3 结束语
